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       【关键词】  夏枯草；,,,积雪草；,,,筋骨草；,,,青蒿素；,,抗结核
       摘要：目的研究中药夏枯草、积雪草、筋骨草和青蒿素的体外抗结核分枝杆菌H37RV的活性。方法采用改良罗氏固体培养基试管培养法进行活性检测。结果夏枯草醇提物抗结核效果明显；积雪草苷片、筋骨草及青蒿素均无效。结论 夏枯草醇提物抗结核菌效果优于水提物；积雪草醇提物有微弱抑制结核杆菌活性，但其有效成分可能不是积雪草苷；青蒿素及二氢青蒿素无抑制结核分枝杆菌的活性。
       关键词：夏枯草；   积雪草；   筋骨草；   青蒿素；  抗结核
       Studies on the Anti-mycobaterium Tuberculosis Activity of 4 Chinese Medicinal Herbs
       BAI Jie,  SUN Haifeng, CHEN Xiangfei
       (Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, China; Chemical Department of Tsinghua University, Beijing 100084, China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the effective antimycobaterium tuberculosis activity of Prunella vulgaris L. ，Centella asiatica (L. ) Urb，Ajuga decumbens Thunb. and artemisini.MethodsAntimycobaterium tuberculosis activities in vitro of the extracts were performed. ResultsThe alcoholic extract of Prunella vulgaris L. had obviously antimycobaterium tuberculosis effect, while the extract of Ajuga decumbens Thunb. and artemisinin were of no effect against tuberclosi.ConclusionThe results suggested that the antimycobaterium tuberculosis activity of Prunella vulgaris L. alcoholic extract was more significant than watersoluble extract of it, and asiaticosides were likely to be noneffective constituents of Centella asiatica (L. ) Urb to tubercle bacillus.
       Key words：Prunella vulgaris L.;   Centella asiatica (L. ) Urb；  Ajuga decumbens Thunb.；  Artemisinin；  Antimycobaterium tuberculosis
   
　　结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，以肺结核最为常见。近20年来，由于受艾滋病的流行、耐药结核病及流动人口增多等因素的影响，全球结核病疫情呈明显上升趋势。肺结核近来又成为世界上杀伤力最大的传染病。数十年来,国际上针对结核菌已开发出近二十种药物, 但均存在副作用大, 易产生耐药性等缺点。 特别是耐药及多重耐药菌株(multiple drugs resistantbacillus tuberculosis , MDR - TB) 的出现,更是对现有的抗结核药物提出了挑战。 同时, 从化学合成物中寻找有效药物的难度日益增大。因此, 近年来从我国丰富的中药资源中寻找有效的抗结核药物, 已引起越来越广泛的重视。本文对4种传统中药进行体外抗结核杆菌活性的研究。
       　　1  材料
       1.1   菌种与培养基 人型结核分枝杆菌H37RV (来源于广州市胸科医院)；实验采用改良罗氏固体培养基,配制方法参考文献［1］。
       1.2   提取物及药品 夏枯草水提物：夏枯草药材(产地:湖北)粗粉,以水为溶剂加热回流提取，过滤，20%乙醇沉淀除去杂质,浓缩,冻干得到粉末,收率7.0%。夏枯草醇提物:同批次夏枯草药材粗粉,以乙醇加热回流提取，浓缩，冻干得提取物，收率6.5%。积雪草醇提物:积雪草药材(产地：安徽)粗粉，75%乙醇加热回流提物,过滤，浓缩，冻干得提取，收率28.3%。筋骨草醇提物:筋骨草药材(产地：安徽)粗粉乙醇加热回流浓缩至无醇味,加热水溶后，冷却沉淀除去杂质,浓缩冻干得提取物，收率9.1%。积雪草苷片：上海雷允上药有限公司（批号031102）利福平胶囊：广东华南制药厂（批号040502）青蒿素,二氢青蒿素： 纯度（HPLC）＞98%, 陈祥飞博士赠送。熊果酸：中国药品生物制品检定所。
       　　2  方法
       2.1  提取物薄层鉴别 夏枯草TLC鉴别条件：展开剂∶环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶冰醋酸20∶5∶8∶0.5， 显色条件：10%硫酸乙醇溶液105℃加热显色。积雪草TLC鉴别条件：展开剂∶氯仿∶甲醇∶水7∶3∶0.5，显色条件：10%硫酸乙醇溶液105℃加热显色。筋骨草TLC鉴别条件：展开剂∶醋酸乙酯∶乙醇4∶1，显色条件：10%香草醛硫酸乙醇溶液105℃加热显色。以上薄层均采用硅胶G板（青岛海洋）展开。
       2.2  含药培养基的制备 取各提取物及积雪草苷片用0.5%吐温-80水溶液溶解或混悬，制成含药浓度分别为5，2，0.5， 0.1，0.02 mg/ml共五个浓度的含药培养基；0.2及0.05 mg/ml的青蒿素和二氢青蒿素培养基；5 mg/ml的利福平培养基，每个浓度平行装2支试管，以0.5%吐温80水溶液作为空白对照培养基。取适量无药改良罗氏培养基上20~30 d后生长良好的H37RV结核杆菌菌株。取上述菌种适量, 置盛0.5%(v/v) Tween80生理盐水的玛瑙研钵中, 研磨成混悬液,将浓度调整至1 mg/ml，再用生理盐水稀释， 使之浓度为0.5×101mg/ml，供接种用。取该菌液0.1 ml， 在无菌条件下分别接种于不同浓度的各培养基中, 使接种菌量约为0.5×103 mg/ml。放入37℃恒温箱中培养，1周后开始观察培养基表面菌落生长情况。
       　　3  结果
       3.1   薄层鉴别结果如图1所示。
       a展开剂：环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶冰醋酸20∶5∶8∶0.5
       b展开剂：氯仿：甲醇∶水7∶3∶0.5；
       c展开剂：醋酸乙酯∶乙醇4∶1
       图1  夏枯草、积雪草和筋骨草提取物薄层鉴别图谱（略）
   
　　夏枯草和积雪草提取物的TLC鉴别采用《中国药典》［2］提供的方法，图1a结果可见夏枯草醇提物中存在与对照品熊果酸相同紫色斑点，夏枯草的水提物极性较大在此弱极性的展开条件下几乎没有位移，也无熊果酸类低极性成分存在。图1b可见积雪草提物中存在着积雪草苷对应的斑点。图1c筋骨草醇提物与药材对应位置有相同的绿色斑点。
       3.2  抗菌实验结果如表1所示。
       表1  4种中药体外抗结核杆菌试验菌落生长情况观察表（略）
       “-”表示无结核杆菌生长；“+”表示肉眼可见菌落生长，其中+号的多少反映出菌落相对生长的多少。其余低浓度样品同空白对照组一样，均无抗菌活性，未在表中列出由表1可见，空白对照组的培养基表面3周后即长满结核杆菌，阳性对照组利福平5 mg/ ml连续5周的培养，培养基表面仍光滑，无结核杆菌生长。夏枯草的水提经过20%乙醇沉淀后的提取物4周内无菌生长，但第5周开始结核菌开始生长。夏枯草醇提物，连续5周培养基表面均无结核杆菌生长。积雪草苷片、筋骨草提物、青蒿素和二氢青蒿素在所研究剂量下，3周后同空白对照组一样，培养基表面结核杆菌均明显生长。
       　　4  讨论
       我国传统中医药抗结核治疗已有2000多年的历史了。夏枯草、积雪草和筋骨草在传统中医药学中均可用于肺结核病的治疗。《中药大辞典》中记载［3］，夏枯草水煎剂对小鼠实验性结核病，能使肺部病变减轻；积雪草苷具有治疗皮肤结核和麻风病等的作用；筋骨草配伍其他中药对肺结核的肺热咯血症状有较好的疗效。桂晓红等［4］采用苏通氏培养基进行研究也发现夏枯草水煎剂有体外抗结核杆菌的作用。而本实验中夏枯草水提物虽有一定的抑制结核分枝杆菌生长的作用，但其乙醇提取物表现出更明显抑菌活性，说明夏枯草中可能不仅存在着水溶性的抗结核的成分，另外还有些极性小的成分具有协同抑制结核杆菌的效果，应该引起重视。我们的研究发现积雪草的醇提物有微弱的抑制H37RV的活性，但是以积雪草苷为主要成分的积雪草苷片却无抑菌活性，说明积雪草抑制结核杆菌的作用可能不是积雪草苷的作用，有关的实验需进一步验证。而筋骨草的醇提物在所研究的剂量条件下体外无抗结核杆菌的作用。另外，我们还选择了抗菌效果较好的青蒿素和二氢青蒿素用于抗结核分枝杆菌的筛选，结果发现所给剂量无抑制结核分枝杆菌H37RV的活性。
       　　参考文献：
       ［1］  赵奎君，徐国钧，金蓉鸾,等. 狼毒类中药对结核杆菌抗菌作用的比较［J］.中国药科大学学报，1995，26（2）：122.
       ［2］  国家药典委员会. 中国药典,Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：198，200.
       ［3］  江苏新医学院. 中药大辞典［M］. 上海：上海科学技术出版社，2001：1828，1875，2405.
       ［4］  桂晓虹，梅  建. 夏枯草对结核分枝杆菌的药物敏感性研究［J］. 中华中西医杂志，2003，4（10）：1461.
       (深圳清华大学研究院，广东 深圳  518057；清华大学化学系，北京  100084)