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       【关键词】  东亚钳蝎提取物；,,GABAA受体；,,NMDA受体；,,癫痫
       摘要：目的研究BmKE对抗戊四氮致癫痫作用及其对致痫小鼠大脑皮层NMDAR和GABAAR的调节作用。方法观察戊四氮（PTZ）致癫痫模型小鼠，丙戊酸钠（VAP，阳性对照）治疗组和BmKE低（L）、中（M）、高（H）剂量治疗组小鼠癫痫发作的潜伏期，应用同位素3H分别标记MK-801和Mucimol，检测小鼠大脑皮层NMDAR和GABAAR的结合活性。结果BmKE（M）能显著延长PTZ致癫痫小鼠的发作潜伏期(P＜0.05)，BmKE（L）作用很小，BmKE（H）治疗组癫痫小鼠发作潜伏期的延长值比BmKE（M）治疗组低。PTZ显著升高致痫小鼠大脑皮层的NMDAR结合活性（P＜0.05），BmKE（L）治疗组小鼠大脑皮层NMDAR结合活性降低，但是无显著性差异，BmKE（M）和BmKE（H）均极显著降低癫痫小鼠大脑皮层NMDAR结合活性（P＜0.001）。BmKE（L）和BmKE（H）显著提高GABAAR结合活性（P＜0.05），BmKE（M）极显著提高GABAAR结合活性（P＜0.001）。结论适量的BmKE能够有效治疗戊四氮引起的癫痫，显著延长癫痫小鼠的发作潜伏期，BmKE抗癫痫的作用机理，可能与其抑制NMDAR结合活性，激活GABAAR的结合活性有关。
       关键词：东亚钳蝎提取物；  GABAA受体；  NMDA受体；  癫痫
       The Modulation of Buthus martensic Karch Extract（BmKE）on Cerebral Cortex NMDA Receptor and GABAA Receptor in Epileptic Mice
 
　　HUANG Yingchun， ZUO Pingping
       (Biochemical Engineering College of Beijing Union University,  Beijing 100023, China； Chinese Academy of Medical Sciences & School of Basic Medicine of Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the antagonism of BmKE on epilepsy of PTZinduced epileptic mice and the modulation on NMDA receptor(NMDAR) and GABAA receptor (GABAAR) binding activities in cerebral cortex. MethodsThe convulsion latent periods of PTZinduced epileptic mice，vaproate sodium（VAP，positive control drug）treating group and BmKE（L），BmKE（M），BmKE(H) treating groups were observed. NMDAR and GABAAR binding activities of cerebral cortex were detected by isotope 3H-tagged MK-801 and mulimol respectively. ResultsBmKE(M) significantly prolonged laten periods of epileptic mice(P＜0.05), BmKE(L) had a few effect on latent periods, the prolonged value of latent periods treated by BmKE(H) was shorter than that treated by BmKE(M). PTZ significantly increased NMDAR binding activities in cerebral cortex of mice (P＜0.05). Both BmKE(M) and BmKE(H) excessively decreased those of PTZ-induced epileptic mice(p<0.001),but those of BmKE(L) treated group had no significant difference with those of PTZinduced epilepsic mice. GABAAR binding activities were reduced by PTZ. (P＜0.005). BmKE(L) and BmKE(H) significantly increased those of PTZinduced epileptic mice(P＜0.05), and BmKE(M) excessively increased those of PTZinduced epileptic mice(P＜0.001).ConclusionSuitable BmKE can prolong latent periods of epilepstic mice induced by PTZ, and has an antiepileptic effect. The effects of BmKE may have relationship between the inhibition on NMDAR binding avtivities and excitation on GABAAR binding avtivities in cerebral cortex of epileptic mice.
       Key words：BmKE；  GABAA receptor；  NMDA receptor；  Convulsion latent period
   
　　东亚钳蝎Buthus martensic Karch是我国传统药材，中医临床用干燥全虫治疗惊风抽搐、风湿痹痛等症［1］。提取分离有效部位，进而纯化有效成分，对其进行药理活性的检测，研究其作用机理将进一步提高其临床应用价值。在实验性癫痫中，GABAAR的Cl-通道阻断剂戊四氮（pentylenetetrazol,PTZ）被广泛应用于诱导产生惊厥、建立癫痫动物模型。早期的研究发现，PTZ不仅具有抑制GABAA受体的效应［2，3］，连续注射还可引起NMDA受体激活，导致Ca2+向细胞内流动［4］。东亚钳蝎在中医临床上常用于同其他药物配伍，控制癫痫的发作，前期研究发现，BmKE能够延长癫痫发作的潜伏期，显著升高被戊四氮抑制的GABAAR的结合活性［5］。BmKE是否还影响NMDAR的结合活性，从而克服PTZ的作用而达到治疗癫痫的作用，为此，我们进一步研究了BmKE对戊四氮致痫小鼠大脑皮层NMDAR的结合活性的影响。本文中我们将讨论BmKE对癫痫小鼠大脑皮层中GABAAR和NMDAR的调节作用，以阐明BmKE抗癫痫的作用机理。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物选用健康昆明系小鼠（一级），体重（20.5±0.9）g，由中国医学科学院动物研究所提供，在自然光线，温度为20~25℃的饲养室喂养，自由进食水。
       1.2  药物与试剂BmKE［5］，VAP， PTZ，Sigma公司产品，同位素： 3HMucimol(GABAAR拮抗剂配基)，NEN公司，3HMK801（NMDAR拮抗剂配基）， Dupont 公司，闪烁剂：PPO, Fluka 公司（进口分装），NMDAR测定采用BECHMANL9800同位素液闪计数仪。
       1.3  动物分组及处理  昆明系小鼠40只，雌雄各半，适应环境3 d后随机分成5组。空白对照组服用蒸馏水0.4 ml/只/d。其余4组用于PTZ癫痫模型的建立。
       1.4  PTZ癫痫模型的建立  PTZ诱导时间均定为下午1：00 ~4：00。动物在服药前均注射PTZ50 mg/kg。建模组动物首次注射PTZ的潜伏期和发作等级无明显差异。于第2天上午9：30灌胃给药。空白对照组和癫痫模型非治疗组服用蒸馏水0.4 ml /(20 g・d)；VAP185 mg/kg，并设计了3种剂量BmKE服用组，其中低剂量250 mg/kg（BmKEL）、中剂量500 mg/kg（BmKEM）、高剂量1000 mg/mg（BmKEH），给药体积 0.4 ml，连续灌服3 d。于最后一次服药后4 h再次腹腔注射PTZ 50 mg/kg。
       1.5  脑突触粗膜制备 为了探讨BmKE抗癫痫的作用机理，第2次腹腔注射PTZ50 mg/kg后，将小鼠断头取脑，制备操作在4℃下进行。称取冻存脑组织，按1∶5（w/v）比例加入预冷的 50 mmol/L pH 7.4 Tris醋酸缓冲液（TAB），在冰浴中用TEKMER组织匀浆器匀浆，用Dupont RC5加入TAB 10 ml离心（21  000 r/min，20 min）。洗涤3次，最后将沉淀悬浮于灭菌的0.32 mol/L蔗糖溶液中，-70℃冻存备用。此即突触粗膜。
       1.6  NMDAR结合实验 将突触粗膜离心洗涤1次后，用0.5 ml TAB稀释。取100 μl 突触膜稀释液，加入200 μl TAB，在非特异性结合管中加入100 μl 0. 1 mmol/L非标记的MK801和100 μl TAB，每管加入0.1 μCi 3HMK801，在30℃水浴中孵育30 min，反应结束后加入预冷的TAB5 ml，抽滤在纤维素滤膜上，并用预冷的TAB20 ml洗涤。将滤膜放入闪烁杯中，75℃左右烘烤30 min后加入甲苯闪烁液7 ml，在液体闪烁计数仪上测定cpm值，结合突触膜蛋白质浓度计算3HMK801结合量（以每毫克蛋白质结合的3HMK801pmol数表示）：3HMK801特异结合=（样本cpm - 非特异结合cpm）×4.926pmol/mg ptot÷总计数cpm。
       1.7  GABAAR受体结合实验 总结合试管采用3HMucimol(1 nmol/L)在Tris柠檬酸缓冲液（TCB，pH 7.1）中与粗膜于2℃孵育30 min，非特异性结合试管另加10-4mmol/L GABA。反应结束后, 加入缓冲液洗涤，负压抽滤于纤维素膜，冲洗3遍，将该膜置于闪烁杯中，加甲苯闪烁液进行测定。特异性结合以总结合减非特异性结合得到。
       1.8  统计方法 采用Cochran ＆ Cox 近似 t检验校正其近似临界值。数据以±s表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.005和P＜0.001为差异极显著。
       　　2  结果
       2.1  BmKE对小鼠癫痫发作潜伏期的影响  采用治疗后癫痫发作潜伏期－治疗前癫痫发作潜伏期的平均值分析，以说明提取物延长发作潜伏期的程度（见表1）。BmKE（L）作用很小，BmKE（M）的治疗效果非常明显（P＜0.05），同VAP相当，但是，提取物剂量的进一步增加，不仅没有增强对癫痫的治疗作用，其治疗作用反而有所下降。
       表1  各组小鼠大脑皮层NMDAR和GABAAR活性比较（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05,**P＜0.005；与PTZ组比较与模型组比较，# P＜0.05, ##P＜0.001
       2.2  BmKE对NMDAR结合活性的抑制作用经PTZ诱发的癫痫小鼠大脑皮层兴奋性氨基酸受体NMDAR与MK801结合活性显著增强（P＜0.05），VAP和BmKE（L）治疗PTZ诱发的癫痫小鼠后，NMDAR与MK801结合活性恢复到接近正常的空白对照（见表1）。并且随着BmKE使用量的增加， NMDAR活性的抑制程度增加，BmKE（M）比BmKE（L）治疗组NMDAR的结合活性降低了接近1倍，与癫痫模型小鼠相比差异极显著（P＜0.001），进一步增加BmKE的浓度对NMDAR结合活性的影响相对较小，BmK（H）治疗组NMDAR结合活性仅比BmKE（M）治疗组的NMDAR结合活性略有下降。见图1。
       图1  BmKE对GABAAR结合活性的影响（略）
       2.3  BmKE对GABAAR结合活性的影响  经过PTZ诱发的癫痫小鼠大脑皮层GABAАR的结合活性与空白对照比较极显著地降低（P＜0.005）。BmKE（L）处理组，GABAАR结合活性显著地升高（P＜0.05），BmKE（M）处理组，GABAAR结合活性极显著的升高（P＜0.001），BmKEH处理组GABAAR结合活性反而下降。见图2。
       图2  BmKE对GABAAR结合活性的影响（略）
       　　3  讨论
       本研究发现，在PTZ诱发的癫痫发作过程中，兴奋性神经递质受体NMDAR和抑制性神经递质受体GABAAR都受到了影响，NMDAR受到激活，而GABAAR受到抑制，因而，中枢神经网络兴奋与抑制失衡，导致癫痫的发生。NMDAR在生物发育过程中有着极其重要的作用，可以调节神经元的存活，树突、轴突结构发育及突轴可塑性等，影响大脑的认知功能和脑细胞的发育，在神经元回路的形成及学习、记忆过程中，NMDAR亦起着关键作用［6］。正常神经系统的发育需要NMDAR活性处于一个动态平衡的最佳水平。过度激动NMDAR是许多神经系统疾病的病因，可使大脑产生包括神经元坏死和细胞凋亡的神经损伤［7］，如NMDAR活性过低则可能使发育延迟，活性过高又可能产生神经元损伤或脑损伤，NMDAR活性调节失衡可能是一些中枢神经系统疾病的基础，如癫痫、缺血性脑损伤及一些神经退行性疾病［8］。朱丽君等［9］发现，戊四氮影响大脑皮层NMDAR亚单位NR2蛋白的表达，尤其是增高NR2A亚单位的表达。GABAAR是临床上广泛使用的神经药物靶标，许多药物与GABAАR上相应位点结合，通过改变构象来增强GABA对受体的作用。GABAAR功能障碍与神经和精神紊乱症如抑郁症、失眠、焦虑和癫痫关系密切。一般认为PTZ是GABAAR的非竞争性拮抗剂［10］。因此，降低NMDAR活性，提高GABAAR活性的物质，具有对癫痫的治疗作用，可以作为抗癫痫的候选药物。本实验发现，PTZ组大脑NMDAR结合活性较正常对照组显著升高（P＜0.05）,阳性药对照组和低剂量处理组NMDAR结合活性下降，没有显著性差异。中剂量和高剂量组NMDAR结合活性极显著下降（P＜0.001），提示BmKE可以抑制大脑皮层NMDAR的活性与表达，降低大脑皮层的兴奋性。我们还发现，PTZ极显著的抑制GABAAR的结合活性，中剂量的BmKE能够极显著的升高被PTZ抑制的GABAAR的结合活性。根据实验，我们作出这样的假设，BmKE可作为GABAAR激动剂，适宜剂量的激动剂，通过恢复GABAAR的结合活性而达到治疗癫痫的作用。BmKE又可作为NMDAR拮抗剂而抑制NMDAR的结合活性。BmKE对GABAAR结合活性和对癫痫小鼠发作潜伏期的影响，都是在中剂量达到最高，高剂量治疗组作用反而降低了，高剂量组虽然仍能够增加NMDAR的结合活性，但是作用效果降低，这一问题还有待进一步的研究。这也说明，在用BmKE进行癫痫治疗时，需要控制剂量，才能达到最好的治疗效果。
       　　参考文献：
       ［1］  吴英良. 我国全蝎及其有效成分的药理毒理研究及临床应用进展 中草药［J］.1995， 26（2）：97.
       ［2］  Meldrum BS. Excitatiry amino acids in epilepsy and potential novel therapies. Epilepsy Res［J］.1992,12(2)：189.
       ［3］  MacDonald RL,Barker JL.Pentylenetetrazole and penicillin are selective antagonists of GABA-mediated postsynaptic inhibition in culture mammalian neurons［J］.Science,1977,267:720.
       ［4］  Nevins MR, Fornai F, Afshar JK, et al. The role of nitric oxide in focally-evoked limbic seizures［J］. Neuroscience,1997,76(4):1231.
       ［5］  黄迎春，左萍萍. 东亚钳蝎提取物对致痫小鼠大脑GABAA受体活性的影响［J］.  北京联合大学学报 2006，1：66.
       ［6］   张锦华，张晓琴，章军建. 迷走神经刺激对戊四氮致痫大鼠丘脑网状核谷氨酸受体的影响［J］. 中国神经免疫学和神经病学杂志 2002，9（3）：125.
       ［7］  Chrysanthy I, Friederike B, Michael M et al.Blockade of NMDA receptors and apoptic neurodegeneration in the developing brain［J］. Science, 1999,283:70.
       ［8］  Yu SP, Yeh CH, Strasser U, et al. NMDA receptor mediated K+ efflux and neuronal apoptosis［J］. Science, 1999, 284:336.
       ［9］  朱丽君，王敏珍，吴晓华，等. 惊厥和亚惊厥剂量戊四唑对大鼠脑内NMDA受体亚单位蛋白表达的影响［J］.  浙江大学学报（医学版），2004，33（3）：213.
       ［10］  Suzanne L，Hansen BB.Sperling and Connie Sanchez. Anticonvulsant and antiepileptogenic effects of GABA receptor ligands in pentylenetetrazole-kindled mice［J］. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry,2004,28(1):105.
       (北京联合大学生物化工学院，北京   100023；中国医学科学院中国协和医科大学，北京  100005)