高效液相色谱法测定救心软胶囊中蟾酥的含量
作者：左玲玲，黄巍，唐灿
《时珍国医国药》 2007年 第1期
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【关键词】 救心软胶囊；,,蟾酥；,,华蟾酥毒基；,,,脂蟾毒配基；,,高效液相色谱法
摘要：目的建立救心软胶囊中蟾酥的主要成分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱 (RP-HPLC)，以 C18为固定相，流动相为乙腈-0.5%磷酸二氢钾(用磷酸调节 pH值为3.0)（45∶55），检测波长296 nm。结果华蟾酥毒基和脂蟾毒配基与其他成分分离良好。华蟾酥毒基在进样量0～5.86 μg（r=0.999 8），脂蟾毒配基在进样量0～5.88 μg（r= 0.999 97）线性关系良好，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基加样回收率为99.81%,RSD为2.25。结论该法操作简便、准确、重现性好,可用于救心软胶囊中蟾酥的质量控制。
关键词：救心软胶囊； 蟾酥； 华蟾酥毒基； 脂蟾毒配基； 高效液相色谱法
Content Determination of Venenum Bufonis in Jiuxin Soft Capsule by HPLC
ZUO Ling ling， HUANG Wei ， TANG Can
(Chengdu Baixinshuhan Pharmaceutical Company , Chengdu,Sichuan,610081,China; Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,610074,China;Xihua University, Chengdu,Sichuan,610039,China)
Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of Venenum Bufonis in Jiuxin Soft Capsule.MethodsRP-HPLC，C18 column, Acetonitrile -0.5% Potassium dihydrogen phosphate (pH 3.0)（45∶55）,and the detection wavelength was set at 296 nm.ResultsThe HPLC method had good linearity within the range of 0～5.86 μg for Cinobufagin, 0～5.88 μg for Resibufogenin.The average recovery of Cinobufagin and Resibufogenin was 99.75%.ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible and it can be used for the determination of Venenum Bufonis in Jiuxin Soft Capsule.
Key words：Jiuxin Soft Capsule； Venenum Bufonis； Cinobufagin； Resibufogenin； HPLC
救心软胶囊系由《卫生部药品标准・中药成方制剂》 “救心丸” 改剂制成的软胶囊剂，处方由牛黄、麝香、冰片、蟾酥、珍珠等八味药组成［1］，具有益气活血、化痰通络之功效，用于痰浊淤血痹阻心脉而致的胸痹心痛，胸闷，短气，心悸，怔忡等。因蟾酥为方中君药，且为毒剧药，其主要成分为华蟾酥毒基和脂蟾毒配基。为保证临床用药安全有效，本文建立用高效液相色谱法同时测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器 岛津 LC-10AT高效液相色谱仪（SPD-10A紫外检测器），浙大 N2000色谱工作站，岛津 AUW-120D电子天平。
1.2 试剂与药品 华蟾酥毒基对照品（中国药品生物制品检定所，批号083-9205）脂蟾毒配基对照品（中国药品生物制品检定所，批号0718-9205）。乙腈为色谱纯,水为超纯水，其余试剂均为分析纯。救心软胶囊为某企业复核样品（批号：030626，030627，030628）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱：Inertsill ODS-35 μm，4.6 mm×250 mm；柱温：40℃；检测波长：296 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。
2.2 供试品溶液的制备取救心软胶囊内容物约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加甲醇100 ml，精密称定，回流提取1 h，放冷，精密称定，以甲醇补足减失的重量，摇匀,滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥24 h的华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品各约5 mg，精密称定，分别置100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密吸取5ml，各置10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀［2］，即得（每毫升中含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基各50 μg）。
2.4 阴性对照溶液的制备取缺蟾酥的救心软胶囊阴性样品2 g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法，制备阴性对照溶液。
2.5 流动相的选择分别考察了以（1）乙腈-0.5%磷酸二氢钾［磷酸调 pH值3.5］（55∶45），（2）乙腈-0.5%磷酸二氢钾［磷酸调 pH值3.0］（55∶45），（3）甲醇-水（60∶40）［3］，（4）乙腈-0.5%磷酸二氢钾［磷酸调 pH值3.0］（40∶60）为流动相，对样品的分离效果。结果以乙腈-0.5%磷酸二氢钾［磷酸调 pH值3.0］（55∶45）为流动相对样品的分离效果最好，主峰已达基线分离，峰形对称。理论塔板数按华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰计算，均不低于4 000。
2.6 分析方法学考察
2.6.1 标准曲线的制备 取华蟾酥毒基标准品约10 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀，作为储备液。取储备液用甲醇依次等倍稀释为5个浓度的对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，华蟾酥毒基在0～5.86 μg范围内线性关系良好。回归方程为 Y=304 536.4 X+0，r=0.999 8。取脂蟾毒配基标准品约10 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀，作为储备液。取储备液用甲醇依次等倍稀释为5个浓度的对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，脂蟾毒配基在0～5.88 μg范围内线性关系良好。回归方程为 Y= 328 108.7 X+0，r= 0.999 97。
2.6.2 精密度实验 精密吸取对照品溶液10 μl，按上述色谱条件重复进样6次，测得华蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰面积积分值的 RSD分别为0.44%，0.48%。
2.6.3 重现性实验 取同一批样品，按“供试品溶液的制备”的方法平行制备供试品溶液5份，按上述色谱条件测定，测得华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总含量的 RSD为1.91%，表明测定方法重现性良好。
2.6.4 稳定性实验 取同一批样品制成的供试品溶液，按上述色谱条件操作，在0，1，4，8，24 h分别进样1次，测得华蟾酥毒基和脂蟾毒配基在24 h内峰面积的 RSD分别为0.83％和0.98％，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6.5 加样回收率实验取已知含量的样品（批号030626）约1.0 g，共9份，精密称定，分别加入不同量华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的对照品，按“供试品溶液的制备”方法制备，按上述色谱条件操作，测得华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的平均回收率为99.81%，RSD为2.25%，回收率良好。结果见表1。
表1 加样回收率实验结果（略）
2.6.6 样品测定 取3批样品，按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，按上述色谱条件操作，记录色谱图(见图1~4),结果阴性对照无干扰。3批样品测定结果见表2。
图1 阴性对照（略）
图2 华蟾酥毒基对照（略）
图3 脂蟾毒配基对照（略）
图4 供试品（略）
表2 样品测定结果（略）
*为每粒中含量
3 讨论
3.1 蟾酥生理活性强，既是有效成分，也是毒性成分，能兴奋中枢神经系统导致惊厥。对其主要成分建立有效的含量测定方法，是保证用药安全的基础。用本法进行蟾酥主要成分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的质量控制,具有简便、快速、准确、重现性好等特点。
3.2 实验考察了不同的流动相对样品的分离效果，结果发现流动相的 pH值对样品的分离效果影响较大，经考察，最后确定水相的 pH值为3.0。
参考文献：
［1］ 中华人民共和国卫生部．卫生部药品标准・中药成方制剂，第19册［S］. 1995：178.
［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：265 .
［3］ 苗明三,李振国.现代实用中药质量控制技术［M］.北京：人民卫生出版社，2000：1130.
(成都百信蜀汉药业有限公司，四川 成都 610081；成都中医药大学，四川 成都 610074；西华大学，四川 成都 610039)