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       【关键词】  双黄连粉针剂；,,绿原酸；,,黄芩苷；,,高效液相色谱法；,,梯度洗脱
       摘要：目的建立高效液相色谱（HPLC）法同时测定双黄连粉针剂中绿原酸和黄芩苷外标定量测定方法。方法用自制C8~C13混合型烷基键合硅胶柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)为固定相，甲醇和水溶液（用磷酸调pH2.7）为流动相，在C8~C13柱上梯度洗脱，流速为1 ml・min-1，紫外检测波长为323 nm。结果绿原酸和黄芩苷的线性范围分别为4.0~100.0 mg・ml-1和 8.6~215.0 mg・ml-1；相关系数分别为0.999 89和0.999 97；加样回收率分别为100.53%和99.94%；检测限分别为0.014 mg ・ml-1和0.020 mg ・ml-1；精密度实验RSD分别为1.12%和 0.61%；重现性实验RSD分别为1.14%和0.73%，稳定性实验RSD分别为0.89% 和 0.54%；4批样品中绿原酸的含量在1.577~1.753 mg・ml-1，黄芩苷的含量在26.02~28.68 mg・ml-1。结论该方法简便，快速，准确，灵敏度高，重现性好，成本低，可用于双黄连粉针剂的质量控制。
       关键词：双黄连粉针剂；  绿原酸；  黄芩苷；  高效液相色谱法；  梯度洗脱
       Quantitative Determination of Chlorogenic Acid and Baicalin in Shuanghuanglian Powder Injection by HPLC
       YANG Ruifen，PENG Jiagang，  ZHOU Rong， DA Shilu  *，YANG Zhi
       （Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; College of Chemistry and Molecular Science,Wuhan University, Wuhan 430072, China; Grade 2003 of Undergraduate, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)
       Abstract：ObjectiveTo develop an RP-HPLC method for the determination of chlorogenic acid and baicalin in Shuanghuanglian powder injection.MethodsA C8~C13mixedalkyl (5μm，4.6 mm×150 mm)bond silica for reversed-phase HPLC was prepared. The mobile phase was CH3OHphosphoric acid solution (pH 2.7). The flow rate was set at 1.0 ml/min. The detection wavelength was at 323 nm. Chlorogenic acid and baicalin were separated by HPLC with grade elution. ResultsThe linearity ranges of chlorogenic acid and baicalin were 4.0~100.0 mg /ml and 8.6~215.0 mg /ml respectively，the correlation coefficients were 0.999 89 and 0.999 97 ,the average recoveries of adding sample were 100.53% and 99.94%, detection limits were 0.014 mg/ml and 0.020 mg /ml,  the RSD (n=5) of measurement precision test were 1.12% and 0.61%, the RSD (n=5) of reproducibility between tests were 0.89% and 0.54%. The content of chlorogenic acid in Shuanghuanglian powder was 1.577~1.753 mg/ml，and that of baicalin was 26.02~28.68 mg/ml. ConclusionThe method is simple, fast, accurate，sensitive, reproducible and low cost. It is fit for the quality control of Shuanghuanglian powder.
       Key words：Shuanghuanglian powder;  Chlorogenic acid;  Baicalin；  HPLC
   
　　双黄连粉针剂是供注射用的中药制剂，由金银花、黄芩和连翘组成，具有清热解毒、辛凉解表的功能。主要成分为绿原酸、黄芩苷，质量控制多采用黄芩苷和绿原酸作为指标。含量测定方法有紫外分光光度法［1，2］、高效毛细管电泳［3，4］及高效液相色谱法［5~9］等。由于该制剂成分中黄芩苷和绿原酸极性相差较大,故质量标准中规定分别测定二者含量。本实验采用自制C8~C13混合型烷基键合硅胶柱［10］，利用梯度洗脱，逐渐降低流动相极性的方法不经分离同时测定四批样品中绿原酸和黄芩苷的含量，以期为该制剂的含量的质量控制提供参考。
       　　1  器材
       1.1  仪器KNAUER高效液相色谱仪（德国）由K-501HPLC泵、分析型动态混合器、K-2600UV Detector、7725i手动进样阀、Eerochrom 2000 Basic Edition 色谱工作站软件V2.05 和T3000柱温箱（北京创新通恒科技有限公司）组成。KQ-400BD型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），C8~C13混合型烷基键合硅胶色谱柱（自制），PHS-3C精密pH计（上海雷磁仪器厂），TU-1900光度扫描仪。
       1.2  药品与试剂双黄连粉针剂（哈尔滨医药股份有限公司，批号 0010207，0306201，0402205，0402206）；绿原酸对照品（中国药品生物制品鉴定所生产，批号 110753-200212）；黄芩苷对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号110715-200212）；甲醇（色谱纯，上海化学试剂有限公司），磷酸（分析纯），重蒸馏水。
       　　2  方法与结果
       2.1  混合型烷基键合硅胶的制备2.0 g经6 mol・L-1HCl活化后的干燥硅胶，悬浮在80 ml无水甲苯中，加入2.0 ml C8~C13烷基三乙氧基硅烷和3滴三乙胺，在氮气气氛中，120℃加热搅拌反应24 h，待冷至室温后，抽滤，分别用甲苯、乙醚、丙酮、甲醇、水洗涤多次，120℃下真空干燥2 h后称重，得约2.2 g固定相。C8~C13混合烷基三乙氧基硅烷是一种石油尾气中的混合烯烃硅氢加成得到的廉价的偶联剂。
       2.2  流动相的制备 流动相A：测试前，甲醇（CR）用G4玻璃漏斗过滤，然后超声30 min，冷却后供测试用；流动相B：取适量重蒸馏水至500 ml烧杯中，通过酸度计和电磁搅拌器，用H3PO4(AR)-H2O（1∶9，v/v）溶液调pH 2.7，以下操作同流动相A。
       2.3  对照品储备液的制备精密称取黄芩苷对照品21.5 mg，绿原酸对照品10.0 mg，分别置50 ml棕色量瓶中，用甲醇-水(1∶1,v/v)溶解定容至50 ml，分别配制成浓度为0.43 mg・ml-1和0.20 mg・ml-1的贮备液，绿原酸置冰箱低温保存。
       2.4  样品溶液及空白对照液的制备 精密称取双黄连粉针剂15 mg置50 ml棕色容量瓶中，加入甲醇-水(1∶1,v/v)适量，超声溶解20 min，冷却，用甲醇-水(1∶1,v/v)稀释至刻度，摇匀，以3 000 r・min-1的转速离心20 min后，用0.45 μm过滤膜过滤，供测试用。另取处方中除金银花、黄芩的其余药材，按规定工艺制备成双黄连粉针剂后，依样品溶液制备方法制成空白液。
       2.5  色谱分离检测条件
       2.5.1  波长的选择对照品中绿原酸和黄芩苷用TU-1900型紫外分光光度计进行紫外扫描，绿原酸在323 nm处有较强的吸收，而黄芩苷在275 nm处有较强吸收,317 nm有次强吸收 。但由于绿原酸在样品中含量较低，而黄芩苷在样品中含量较高（约为绿原酸的15倍），为了提高绿原酸检测灵敏度，故选323 nm作为测定波长。
       2.5.2  流动相的组成及酸度的选择 在流动相的pH值固定不变时，被分离组分随梯度起始甲醇含量的下降而逐渐分开，当梯度起始甲醇含量从25%（MeOH-H2O,v/v）继续下降时，色谱峰变宽，柱效下降，分离效果变差，因此，固定梯度起始甲醇含量为25%（MeOH-H2O,v/v）。在流动相梯度固定不变时，改变pH值，色谱峰随pH值下降变窄，柱效提高，保留时间缩短，分离效果提高，当pH值下降到2.7时，待测组分与其他组分实现基线分离，因此，固定流动相的pH值为2.7。
       2.5.3  色谱分离条件及色谱分离图色谱柱为C8~C13混合烷基键合相（ 5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相：A：甲醇，B：水（用磷酸调至pH2.7），梯度洗脱：0~7 min，A25%，7~9 min，A25%~40%，9~15 min，40%~50%，流速 1 ml・min-1，柱温：30℃，检测波长：323 nm，进样量20 μl。在上述优化的色谱条件下得色谱分离图（见图1）。对照品中绿原酸和黄芩苷的保留时间分别为6.030，17.749 min；拖尾因子分别为1.033，1.115；柱效分别为14 198，242 834。样品中绿原酸和黄芩苷的保留时间为6.033，17.750 min，拖尾因子分别为1.054，1.158，柱效分别为14 198，242 834，待测组分与邻近组分达到了基线分离。
       2.6  方法学考察
       2.6.1  线性关系考察及检出限精密称取上述贮备液各0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，3.0，4.0，5.0 ml至10 ml容量瓶中，用甲醇-水（1∶1,v/v）稀至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔过滤膜过滤后，按上述色谱条件进行测定。以标准物的峰面积为（A）为纵坐标,标准溶液浓度(C)为横坐标,得绿原酸和黄芩苷的线性回归方程： A=-0.150 83+1.014 63C，r=0.999 89 A=-0.454 37+0.599 63C，r=0.999 97结果表明:绿原酸在4.0~100.0 mg・ml-1浓度范围内呈线性关系，黄芩苷在8.6~215.0 mg ・ml-1浓度范围内呈线性关系。按信噪比3∶1计，绿原酸和黄芩苷的检出限分别为0.27 ng和0.39 ng。
       2.6.2  样品的测定 按上述测定条件对“2.4”项下的样品溶液进行测定。分别由线性回归方程求得绿原酸和黄芩苷的浓度。结果见表1。
       a-绿原酸对照品；  b-黄芩苷对照品；  c-样品；1-绿原酸；  2-黄芩苷;  d-空白样品
       图1  双黄连粉针剂对照品和空白样品的色谱分离图（略）
       表1  样品含量测定结果（略）
       2.6.3  回收率实验 精密称取已知含量的双黄连粉针剂（批号：0402206）14.8 mg两份于2个50 ml棕色容量瓶，加入甲醇-水（1∶1,v/v）适量，超声溶解20 min，冷却，分别加入绿原酸0.40，0.60，0.8 ml，黄芩苷0.40，0.60，0.8 ml，再用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔过滤膜过滤后，按上述色谱条件测定。结果见表3。
       表2  绿原酸及黄芩苷回收率测定结果（略）
       2.6.4  精密度实验分别精密吸取绿原酸和黄芩苷对照品溶液1.2 ml，用50%的甲醇稀至10 ml容量瓶中摇匀，用0.45  μm微孔过滤膜过滤后，按上述色谱条件下，日内重复测定5次，日间重复测定5次，日内测定绿原酸的平均峰面积为25.0213，RSD为1.12%；测定黄芩苷的平均峰面积为30.3104，RSD为0.61%。日间测定绿原酸的平均峰面积为24.6852,RSD为1.73%，黄芩苷的平均峰面积为为29.7034，RSD为0.71%。结果见表3。
       表3  精密度实验测定结果（略）       
       2.6.5  重现性实验取同一批号（0402206）双黄连粉针剂5份，按样品测定项下测定，5份双黄连粉针剂中，绿原酸的测定结果分别是1.727%，1.710%，1.723%，1.728%，1.740%，平均含量为1.726%，RSD=0.52%，黄芩苷的测定结果分别是26.36%，26.09%，26.30%，26.26%，26.29%，平均含量为26.26%，RSD=0.39%。
       2.6.6  稳定性实验 精密吸取样品溶液（批号0402206），按“2.5”项下测定，分别在0，2，4，6，8，10，12 h测定绿原酸和黄芩苷的峰面积，其RSD分别为0.82%和1.02%，说明至少在12 h内可进行准确的定量分析。
       　　3  讨论
       从表1可知，不同厂家不同批号的双黄连粉针剂中绿原酸和黄芩苷的含量各不相同，黄芩苷的测定与《中国药典》方法进行比较，两种方法测定的结果非常吻合，但药典方法只能单一测定黄芩苷的含量，不能同时测定黄芩苷和绿原酸的含量。为了保证其质量，选择一种简便、快速、准确的定量方法控制其质量是至关重要的。文献［6，7］也是采用高效液相法同时测定两种组分，但均为进口ODS柱，价格比较昂贵。本方法采用C8~C13混合烷基三乙氧基硅烷和自制球型硅胶合成了混合型烷基键合相液相色谱固定相，价格低廉，利用梯度洗脱两种组分也得到很好的分离，且方法简单，结果准确，说明可用廉价的C8~C13柱代替较昂贵ODS柱，对双黄连粉针剂的质量进行控制，具有实际意义。
       　　参考文献：
       ［1］  李茂森.一阶导数光谱法测定双黄连口服液中黄芩苷的含量［J］.基层中药杂志，1996，10（2）：32.
       ［2］  栾士香.系数倍率法测定双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸、连翘甙的含量 ［J］.中国中药杂志，1991，16（10）：602.
       ［3］  程智勇，韩凤梅，蔡  敏，等. HPCE法测定双黄连口服液中黄芩苷和绿原酸的含量［J］.药学学报,1999，34 （11）：854.
       ［4］  郑一宁，谢天尧，莫金垣，等.双黄连粉针剂中黄芩苷的高效毛细管电泳-电导法测定［J］.分析测试学报，2001，20（6）：21.
       ［5］  华菊根，胡立君，李国忱. 注射用双黄连质量标准的研究［J］.中成药，1996，18（11）：13 .
       ［6］  马洪波，邓光瑞，李兴斌，等. 改进HPLC法测定双黄连粉针剂中黄芩苷和绿原酸含量［J］.中医药学报, 1999，1：59.
       ［7］  张少年，杨少芳，陈继业，等. HPLC 同时测定双黄连注射剂中绿愿酸和黄芩苷2种指标成分含量［J］.中国现代应用药学杂志,1999，16（6）：47.
       ［8］  莫志江，莫可元. 反相高效液相色谱法测定双黄连口服液中黄芩苷含量［J］.时珍国医国药， 2000，11（3）：196.
       ［9］  刘渝君，娄志红，严沪明. HPLC测定双黄连口服液中绿原酸含量 ［J］.黑龙江医药，2003，16（1）：4.
       ［10］  冯钰，达世禄，王忠华. 混合型烷基键合硅胶液相色谱固定相的合成与性能评价［J］.应用化学，1999，16（14）：55.
       (湖北中医学院，湖北 武汉  430065；  武汉大学化学与分子科学学院，湖北 武汉  430072；华中科技大学同济医学院,湖北 武汉  430030)