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       【关键词】  脑缺血；,,雌激素受体α；,,葛根素；,,雌激素；,,免疫组织化学
       摘要：目的探讨脑缺血损伤后ERα阳性细胞的动态变化及葛根素对其影响。方法制作大脑中动脉阻断模型,使用免疫组化方法观察缺血不同时间ERα免疫阳性神经元的表达。结果在脑缺血后不同时间点,假手术组、雌激素组和葛根素组ERα阳性神经元数量均高于对照组。结论 葛根素可以上调脑缺血后ERα免疫阳性神经元的表达,可能通过ERα发挥对脑缺血半暗带神经元的保护作用。
       关键词：脑缺血；  雌激素受体α；  葛根素；  雌激素；  免疫组织化学
       The Effect of Puerarin on Estrogen Receptor Alpha Positive Neurons of Rats after Focal Cerebral Ischemia
 
　　SONG Hongshan,HE Keli，WANG Jianmin
       （Department of Anatomy,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004,China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of puerarin on estrogen receptor alpha(ERα)positive neurons of rats after focal cerebral ischemia.MethodsUsing a model of focal cerebral ischemia  which was introduced by occluding middle cerebral artery, and then observing the expression of ERα positive neurons at different ischemic time and the change after giving estradiol benzoate or puerarin with the methods of immunohistochemistry. ResultsIn sham  OVX group, estradiol benzoate treatment group and puerarin treatment group, ERα positive neuron expression was higher than that in the OVX control group at different ischemic time. ConclusionPuerarin can increase the expression of ERα positive neurons at various times after middle cerebral artery occlusion and protect nerve cells of ischaemic penumbra.
       Key words：Cerebral ischemia;   Estrogen receptor;   Puerarin;   Estrogen;   Immunohistochemistry
   
　　研究证实雌激素对缺血性脑损伤具有保护作用，如雌性动物比雄性动物对脑缺血性损伤的耐受性强［1］， 雌激素对培养的神经细胞有保护作用［2，3］。葛根素是由豆科植物野葛或甘葛藤根中提取的一种黄酮苷，具有雌激素样作用，但其对脑缺血后半暗带雌激素受体阳性神经元表达的影响尚未见报道。本研究旨在通过使用开颅法建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,用免疫组化方法观察苯甲酸雌二醇和葛根素对缺血半暗带雌激素受体α(ERα)阳性神经元变化的影响，以期进一步揭示葛根素的脑保护作用机制，为葛根素防治脑血管病提供理论依据。
       　　1  材料与方法
       1.1   动物取健康SD大鼠72只，雌性，鼠龄3～4个月，体重250～300 g，由江西医学院实验动物中心提供。20～25℃饲养，保持自然的昼夜节律，自由饮食饮水。大鼠随机分为对照组（卵巢切除+MCAO+生理盐水）、假手术组（假卵巢切除术+MCAO+生理盐水）、雌激素组（卵巢切除+MCAO +雌激素治疗）、葛根素组（卵巢切除+MCAO +葛根素治疗）。每组根据缺血时间不同分别分为缺血24，48 h，7 d 3个亚组,每个亚组6只。对照组、雌激素组、葛根素组大鼠做卵巢切除(OVX)手术。假手术组暴露卵巢但不切除卵巢,其余同对照组。雌激素组和葛根素组OVX术后3 d起每天分别腹腔注射苯甲酸雌二醇(上海通用药业股份有限公司，1 mg/kg)和葛根素针剂(北京四环科宝制药有限公司,50 mg/kg)连续注射14 d,对照组和假手术组以同样方式注射等量生理盐水。OVX术后17 d参照文献［4］制作大脑中动脉闭塞模型。MCAO术后各组大鼠继续给予相应的雌二醇、葛根素和生理盐水,至24 h，48 h，7 d各组分别取6只以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸经左心室快速灌流0.1MPBS和4%多聚甲醛溶液,开颅取脑后固定4 h，将脑组织先后置于20%，30%蔗糖磷酸缓冲溶液中4℃过夜，待脑组织下沉后参照大鼠脑立体定位图谱，取含有基底前脑和缺血灶的组织块,置于冰冻切片机上做连续冠状切片,片厚25 μm，每个脑取相邻的6套切片。取1套进行ERα免疫组化染色。
       1.2   ERα的免疫组织化学检测 采用SABC法进行免疫组织化学染色。一抗(兔抗ERα多克隆抗体)为Santa Cruz公司产品，SABC免疫组化试剂盒为博士德公司产品。切片加一抗 (1∶200)入4℃冰箱孵育过夜；滴加生物素标记的羊抗兔IgG(1∶100) 37℃孵育1 h；SABC复合物(1∶100)37℃孵育1 h； DAB显色液中显色5 min。裱片、脱水、透明、中性树胶封片。每只大鼠脑组织取切片2张，光镜下随机计数缺血灶周围5个不重叠视野（200×）的ERα阳性神经元个数。
       1.3  统计分析运用SPSS 11.5软件对实验数据进行单因素方差分析(SNK法)。P＜0 .05为差异有统计学意义。
       　　2  结果
       在缺血半暗带可见ERα阳性神经元分为两种类型:第一种类型为胞浆和突起着色,胞核轻微着色或不着色,绝大多数的ERα阳性神经元为此类型(见图7，8)；第二种类型为浓密的胞核着色,胞核呈圆形或椭圆形,散在分布在第一种类形神经元之间(见图9)；此外尚可见到少量的星形胶质细胞被染色(见图10)。各组组内比较ERα阳性神经元数量从缺血24 h开始到第7天逐渐减少；各组缺血24，48 h和7 d后假手术组、雌激素组和葛根素组ERα阳性神经元数量均高于对照组,有显著性差异；假手术组、雌激素组和葛根素组3组之间两两比较无显著性差异；各组组内不同时间点比较有显著性差异。见表1及图1。
       表1  ERα阳性神经元计数（略）
       与对照组组间比较，*P＜0.05,与24 h比较，☆P＜0.05；各组缺血7 d与各组缺血48 h比较，★P＜0.05
   
　　图1  对照组 24 h ER     免疫组化200×（略）           
       图2  假手术组24 h ERα     免疫组化200×（略）
       图3  雌激素组24 h ERα     免疫组化200×（略）     
       图4  葛根素组24 h ERα     免疫组化200×（略）
       图5   对照组7 d ERα     免疫组化200×（略）     
       图6  假手术组7 d ERα     免疫组化200×（略）
       图7  雌激素组7 d ERα     免疫组化200×（略）     
       图8  葛根素组7 d ERα     免疫组化200×（略）
       图9  葛根素组24 h ERα     免疫组化200×（略）     
       图10  葛根素组7 d ERα     免疫组化200×（略）
       　　3  讨论
       雌激素受体(ER)属甾体激素受体超家族成员,ERα和ERβ两种亚型分别在1986和1996年被克隆。中枢神经系统的ER除了主要存在于与生殖功能有关的组织(如边缘系统)外，在大脑皮质、海马等脑区锥体细胞中也广泛存在。Blaustein［5］发现ER在中枢神经系统内不仅存在于细胞核内，也存在于细胞浆、轴突末端和突触之中。本研究显示在缺血半暗带可见ERα阳性神经元分为胞浆着色和胞核着色两种类型,这与Blaustein的研究结果一致。此外,尚可见到星形胶质细胞被染色，这也与国外学者［6,7］发现海马的星形胶质细胞有ERα表达的结果一致,进一步证实了星形胶质细胞有ERα表达。雌激素主要包括雌二醇、雌酮及雌三醇，其中雌二醇作用最强。流行病学研究表明，绝经前女性卒中的发病率低于同龄男性［8］，而绝经后心脑血管病的发病率几乎与同龄男性相同［9］，外源性雌激素替代治疗可使卒中的发病率和病死率明显下降，因此推测雌激素对缺血性脑损伤具有保护作用。本研究显示雌二醇组ERα免疫阳性细胞数量在各时间点均高于对照组,并且与假手术组比较无显著性差异(P＞0.05)。有学者［10］认为在雌激素对抗脑缺血时的迟发性神经元坏死的保护机制中ERα可能发挥重要作用。由此推测外源性雌激素或内源性雌激素在脑缺血时都可能通过上调ERα的表达来起到对神经元的保护作用。葛根素由豆科植物野葛或甘葛藤根中提取，成分为 4，7－二羟基8βD葡萄糖基异黄酮（分子式为C21H20O9），具有明确的扩张冠状血管、脑血管和改善微循环等作用，近年来广泛应用于心脑血管疾病的治疗。研究显示葛根素作为一种异黄酮类化合物具有雌激素样作用,如葛根提取物能显著提高去卵巢大鼠阴道和子宫重量，改善子宫萎缩状况，能增加去卵巢大鼠血清雌二醇含量，降低黄体生成素含量［11］；葛根素可以使永久性大脑中动脉阻断模型去势雌性大鼠的大脑皮层正常神经细胞密度显著增加，缺血侧cfos表达阳性细胞数明显减少，凋亡细胞数量显著减少，脑梗死体积百分比也明显缩小［12］；下调caspase3蛋白,上调Bcl2蛋白［13］；降低脑缺血再灌注后脑组织中TNFα，IL1β的含量,减轻病灶处白细胞的聚集,从而阻止局部的炎症级联反应［14］。这说明葛根素既具有雌激素样作用,又有对脑缺血后神经元的保护作用。本研究显示缺血24，48 h和7 d后假手术组、雌激素组和葛根素组ERα阳性神经元数量均高于对照组,有显著性差异。还有人发现在大脑中动脉梗塞后24 h内, ERα mRNA表达上调［15］,在梗塞区观察到与发育有关的蛋白表达明显增高［16］。葛根素的脑保护作用机制可能和雌二醇相同，都是通过ERα来发挥脑保护作用。本研究还显示假手术组、雌激素组和葛根素组3组之间两两比较无显著性差异,可以推测葛根素通过上调ERα来发挥脑保护作用的效果和雌激素相当。此外,我们在实验中发现葛根素可以上调缺血半暗带星形胶质细胞的表达(另文报道),而吴喜贵等［17］发现体外培养的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞可以分泌雌激素。这种内源性的雌激素也可能作用于神经元或星形胶质细胞的雌激素受体发挥对神经元的保护作用。总之，我们的研究表明葛根素可以上调脑缺血后ERα的表达,可能通过ERα发挥对脑缺血半暗带神经元的保护作用。葛根素作为一种植物雌激素在缺血性脑血管疾病的防治中有着广泛的应用前景。
       　　参考文献：
       ［1］  Hall ED，Pazara KE, Linseman KL．Sex differences in postischemic neuronal necrosis in gerbils［J］．J Cereb Blood Flow Metab，1991，11(2)：292.
       ［2］  Regan RF, Guo Y．Estrogens attenuate neuronal injury due to hemoglobin, chemical hypoxia, and excitatory amino acids in murine cortical cultures［J］．Brian Res.1997，764(1～2)：133.
       ［3］  Singer CA， Rogers KL, Strickland TM, et a1．Estrogen protects primary cortical neurons from glutamate toxicity［J］． Neurosci Lett,1996，212(1)：13.
       ［4］  刘小光，徐理纳.一种能评价溶栓和抗栓药的大鼠大脑中动脉血栓模型［J］.药学学报，1995,30(9):662.
       ［5］  Blaustein JD. Cytoplasma estrogen receptors in rat brain:immunocytochemical evidence using three antibodies with distinct epitopes［J］.Endocrinology, 1992,131(3): 1336.
       ［6］  Hu XY, Qin S, Lu YP, et al.Decreased estrogen receptor-α expression in hippocampal neurons in relation to hyperphosphorylated tau in Alzheimer patients［J］. Acta Neuropathol,2003，106(3):213.
       ［7］  Lu YP, Zeng M, Hu XY, et al. Estrogen receptor αimmunoreactive astrocytes are increased in the hippocampus in Alzheimers disease［J］. Exp Neurol,2003，183(2):482.
       ［8］  Petitti DB，Sideny S，Bernstein A，et a1． Stroke in users of lowdose oral contraceptives［J］．N Engl J Med，1996,335(23):1767.
       ［9］  Wenger NK，Speroff L，Packard B． Cardiovascular health and disease in women［J］．N Engl J Med，1993，329(4)：247.
       ［10］  Dena B. Dubal, Shane W. Rau1, Paul J. Shughrue，et al. Differential Modulation of Estrogen Receptors (ERs) in Ischemic Brain Injury:A Role for ERα (alpha) in EstradiolMediated Protection Against Delayed Cell Death［J］.Endocrinology, Published online ahead of print March 9, 2006 as doi:10.1210/en.2005.
       ［11］  薛晓鸥,金  哲，魏育林,等.葛根提取物对去卵巢大鼠阴道子宫及垂体性轴激素变化的影响［J］.北京中医药大学学报,2002,25(6):28.
       ［12］  么晓轶,李  颖.植物雌激素对去势雌性大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志,2005,12(3)：160.
       ［13］  朱  蕾,何丽娅.葛根素对大鼠脑缺血再灌注后凋亡相关蛋白的影响［J］.中华实用中西医杂志,2004,4(17):1120.
       ［14］  杨  黎,何世银.葛根素对大鼠脑缺血再灌注后炎性细胞因子变化的影响［J］.中国老年医学杂志,2003,3(23):173.
       ［15］  Patrone C, Pollio G, Vegeto E，et al. Estradiol induces differential neuronal phenotypes by activating estrogen receptorαorβ［J］. Endocrinology, 2000, 141(5)：1839.
       ［16］  Cramer SC, Chopp M. Recovery recap itulates ontogeny［J］. Trends Neurosci, 2000, 23(6): 265.
       ［17］  吴喜贵，杨  忠，胡  荣，等. 大鼠星形胶质细胞体外分泌雌激素的检测［J］.第三军医大学学报,2004,26(19)：1748.
       (江西中医学院，江西 南昌  330004)