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       【关键词】  姜黄素类化合物；,,肝癌；,,子宫内膜癌
       摘要：目的从中药姜黄提取3种姜黄素类化合物并对它们进行抗肝癌细胞和子宫内膜癌作用研究。方法采用柱层析法从姜黄提取物中分离出3种姜黄素类化合物，用MTT法测定其抗肝癌细胞和子宫内膜癌作用。结果3种姜黄素化合物分别鉴定为姜黄素脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素。0.01 mg/ml双脱甲氧基姜黄素， 0.01 mg/ml和0.001 mg/ml脱甲氧基姜黄素能明显抑制肝癌细胞的生长；0.01 mg/ml和0.001 mg/ml双脱甲氧基姜黄素， 0.01 mg/ml脱甲氧基姜黄素, 0.01 mg/ml 和 0.001 mg/ml姜黄素能明显抑制子宫内膜癌细胞的生长。结论 一定浓度的姜黄素化合物能明显抑制肝癌和子宫内膜癌细胞的生长。
       关键词：姜黄素类化合物；  肝癌；  子宫内膜癌
       Isolation of Curcuminoids and its Effects on Liver Cancer and Endometrial Carcinoma
       PENG Bingxian, ZHOU Xin, SHI Jingshan
       (College of Chemistry and Chemical Engineering , Jiangxi Normal University,  Nanchang 330022, China; The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences , Guiyang  550002 ,China; Zunyi Medical College, Zunyi  563003, China)
       Abstract：ObjectiveTo extract three curcuminoids from Curcuma langa and study there effects on liver cancer and endometrial carcinoma.MethodsThree curouminoids were got from the extract of Curcuma langa with column chromatography and their effects on liver cancer and endometrial carcinoma were determined by MTT. ResultsThree curcuminoids were identified as curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin. It showed that 0.01mg/ml curcumin，0.01mg/ml  and 0.001mg/ml demethoxycurcumin could resist liver cancer ,  0.01mg/ml and 0.001 mg/ml bisdemethoxycurcumin，0.01mg/ml demethoxycurcumin, 0.01mg/ml and 0.001 mg/ml curcumin could resist endometrial carcinoma cells. ConclusionIt is an effective method that curcuminoids are separated from Curcuma langa with column chromatography in this experiment. The three curcuminoids have good antitumor effects  on liver cancer and endometrial carcinoma cells .
       Key words：Curcuminoid;   Liver cancer;  Endometrial carcinoma
   
　　近年来，姜黄素类化合物(curcuminoids)的研究工作在国内外都颇受重视。它们是中药姜黄的主要有效成分，主要包括姜黄素(curcumin)、脱甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)和双脱甲氧基姜黄素(bisdemethoxyocurcumin)3种。这3种酚类色素相近的结构使它们具有多方面相似的药理作用，如抗炎、抗氧化、降血脂，特别是它的抗诱变和抗肿瘤作用［1］。但是结构上的微小差异又使3种姜黄素在抗肿瘤、抗氧化作用等方面的能力有较大差异［2］。因此从姜黄中提取出较为纯净的3种姜黄素混合物，再进一步将它们分离，对于实际药品生产将会具有良好的指导作用和应用价值。本文就姜黄素类化合物的分离纯化和结构鉴定提供了一种很好的途径并就这3种姜黄素类化合物的抗肝癌和子宫内膜癌作用作出详细的研究。
       　　1  仪器与材料
       XT4双目显微熔点测定仪（未校正），UV用HP8453紫外光谱仪测定，MS用HP5973质谱仪测定，EI离子源. Varian INOVO 400MHz型核磁共振仪（TMS内标）。薄层色谱硅(G)和柱层析硅胶(200～300目)均为青岛海洋化工厂产品。中药姜黄购于四川仙森公司，其品种及来源为Curcuma. Langa L 的根茎。RPMI1640培养液（华美公司分装）；MTT制剂（华美公司分装）二甲基亚砜（DMSO由上海金山华工厂提供，分析纯，批号：20020514）。姜黄素(J1)、脱甲氧基姜黄素(J2)和双脱甲氧基姜黄素(J3)用50%DMSO配制，再用RPMI1640培养液稀释成0.01，0.001 ，0.000 1 mg/ml备用；DMSO用RPMI1640稀释成5%，0.5%，0.05%用作溶媒对照。子宫内膜癌细胞及肝癌细胞均为贴壁生长型细胞，细胞株由遵义医学院微生物教研室提供。
       　　2  方法与结果
       2.1  姜黄素类化合物的分离
       2.1.1  提取、分离与纯化姜黄的干燥根茎，粉碎，过40目筛，用石油醚（30～60℃）回流5 h 2次脱脂。残渣用甲醇冷浸提取12 h，得黄色膏状物，膏状物进行柱色谱。于Φ=15 mm，L=1200 mm的玻璃层析柱中，以氯仿、甲醇和甲酸（96∶4∶0.1）的混合溶液为淋洗剂，分别将3个黄色色带洗脱下来。将Rf值相同的溶液合并，得到3种姜黄素类化合物溶液，记为J1, J2和J3。参照文献方法［3］，用少量丙酮分别溶解3种姜黄素类化合物，向溶液中快速加入三蒸水至混浊，然后剧烈振荡至混浊液透明并有絮状沉淀出现，再以13 000 r/min离心5 min，弃去上层清液，用氮气吹干沉淀物。重复上述操作3次。
       2.1.2  结构鉴定化合物J1：黄色晶体, Mp 183~184℃, UV lmaxCH3OH 422 nm，1HNMR(CD3OD, 400MHz)δppm：4.13 (6H, s), 6.85 (2H, s), 7.58 (4H, dd,8.0,2.0), 7.95(2H,d,2.0), 8.12(2H,s), 8.34(2H,d,8.0), 10.41 (2H,bs).EI MS m/z：368 (M+,20), 350(24), 320(11),272(18), 232(18), 217(32), 202(6), 177 (100), 145(67), 117(18), 89(36), 52(8), 32(23),14(15)，与文献［4］对照确定为姜黄素,其分子式为C21H20O6。化合物J2 ：黄色晶体, Mp 163185℃, UV lmaxCH3OH 418 nm，1HNMR(CD3OD, 400 MHz)δppm：4.63（3H, s）, 7.58 (2H, dd,8.0, 20), 7.63(4H,d,8), 7.94(2H,d,2), 8.13(1H,s), 8.33 (2H,d,2), 8.38(2H,d,2), 10.47 (1H,s),10.86(1H,s). EI-MS m／z：338(M+,65), 320(80), 305(10),277(7), 242(28), 217(33), 191(64), 177(57), 161 (21), 147(100), 119(37), 91(32), 69(28), 43 (26),18(66)，与文献［5］对照确定为脱甲氧基姜黄素，其分子式为C20H18O5。化合物J3：黄色晶体, Mp 208～213℃, UV lmaxCH3OH 412 nm，1HNMR(CD3OD, 400MHz)δppm：7.43（4H, dd, 8.0, 2.0）, 7.57 (4H,s), 8.32(6H,s), 10.81(2H,s). EI-MS m/z：308(M+,100), 290(20), 262(6), 202 (28), 187(26), 160(50),147 (80), 133 (15), 107(29), 83(24), 57(32), 43(38), 28 (26)，与文献［6］对照确定为双脱甲氧基姜黄素，其分子式为C19H16O4。
       2.2  姜黄素类化合物的抗肿瘤作用
       2.2.1  体外抗肿瘤实验分为不同浓度的试药组、不同浓度的DMSO组（作溶媒对照）、空白对照组。取对数生长期的子宫内膜癌细胞及肝癌细胞用RPMI1640培养液配成5×104/ ml 的细胞悬液，接种于96孔板上，200 μl / 孔，置37℃，5%CO2环境下培养24 h，待细胞贴壁后加入不同浓度的试药及不同浓度的DMSO，每孔均为20 μl，6 h后用MTT法检测细胞活性。
       2.2.2   MTT法测定细胞毒培养结束后，每孔加入5 mg/ml的MTT应用液20 μl/ 孔，继续培养4 h，去上清液，加入200 μl/ 孔DMSO，震动，待结晶完全溶解后用酶标仪测定每孔OD值，测量波长为490 nm。
       2.2.3  结果各种试药对肝癌细胞的作用结果见表1。由表1可知， 0.01 mg/ml双脱甲氧基姜黄素，0.01 mg/ml和0.001 mg/ml脱甲氧基姜黄素能明显抑制肝癌细胞的生长。
       表1   各种试药对肝癌细胞的影响（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01各种试药对子宫内膜癌细胞的作用结果见表2。由表2可知， 0.01 mg/ml和0.001 mg/ml双脱甲氧基姜黄素， 0.01 mg/ml脱甲氧基姜黄素, 0.01 mg/ml 和 0.001 mg/ml姜黄素能明显抑制子宫内膜癌细胞的生长。
       表2  各种试药对子宫内膜癌细胞的影响（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
       　　3  讨论
       淋洗剂和展开剂中加入微量的甲酸对姜黄素类化合物起离子抑制作用，使得分离不拖尾，保证它们完全分离。关于姜黄素类化合物抗肿瘤作用报道较多，但报道大多是药材总提取物的药理活性及其在临床上的应用,而对其物质基础化学成分和药效、作用机理及二者的相关性的研究却少有报道。寻找与中医用药功能主治基本吻合的有效成分来控制药材的品质是研究的关键。我们用硅胶柱层析从姜黄中分离出3种姜黄素类化合物分别进行了抗肝癌和子宫内膜癌研究，为姜黄素类化合物的抗肿瘤作用研究提供直接依据，也为姜黄素类化合物抗其他方面的肿瘤提供了新的思路。
       　　参考文献：
       ［1］  Ammon HPT, Wahl MA. Pharmacology of curcuma longa［J］. Plant a Med, 1991， 57:1.
       ［2］  C.Rasmussen , K.Kvist. A Simple and efficient separation of the Curcumins , the Antiproto- zoal Constituents of Curcuma longa［J］. Plamta Med, 66(2000):396.
       ［3］  杨  云，张  晶.姜黄降血脂部位的成分分析［J］.浙江中医学院学报，1999，23（6）：22.
       ［4］  王贤纯. 活性炭柱层析法分离姜黄素［J］.生物学杂志，2000，17(6)：8.
       ［5］   赵德永，杨模坤.姜黄及其制剂中姜黄素类化合物的高效液相色谱分离及测定［J］. 药学学报，1986, 2(5)：382.
       ［6］  陈毓亨，章  菽，胡治海，等，我国姜黄属植物的研究［J］.中药材，1986，9(4)：20.
       (江西师范大学化学化工学院, 江西 南昌  330022；中国科学院天然产物化学重点实验室, 贵州 贵阳  550002；遵义医学院，贵州  遵义  563003)