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       【关键词】  人参皂苷Rg3；,,细胞凋亡；,,血管内皮生长因子
       摘要：目的观察人参皂苷Rg3对小鼠肝癌细胞凋亡的诱导作用，及肿瘤血管内皮生长因子（VEGF）的变化，探讨Rg3抗肿瘤生长及抑制转移的机制。方法以Hca-F25//6A3-F(F)接种于615近交系小鼠，建立肝癌转移动物模型，分为5组：Rg3预防组（接种肿瘤前给Rg3）、Rg3治疗组（Rg3）、阳性对照组(PDD)、联合治疗组 (Rg3+ PDD)和阴性对照组 (生理盐水)，通过电镜及流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡，并应用免疫组化方法检测VEGF的表达。结果人参皂苷Rg3预防组及治疗组电镜下可见较多细胞凋亡小体的形成；顺铂治疗组的形态改变以细胞破坏为主，凋亡的细胞较少；联合治疗组细胞的凋亡和坏死程度相当。流式细胞学检测分析结果为：Rg3预防组、治疗组及联合治疗组细胞凋亡的特征峰 (5/5), 而顺铂治疗组为（1/5），阴性对照组未见。应用Rg3各组均较未用药组VEGF表达减少。结论人参皂苷Rg3抗肿瘤生长及抑制转移的机制与诱导细胞凋亡、降低肿瘤血管生成有关。
       关键词：人参皂苷Rg3；  细胞凋亡；  血管内皮生长因子
       我国传统中药中有很多具有抗肿瘤作用的成分，如半枝莲、薏米仁、石上柏、人参、黄芪等。人参皂苷Rg3是从祖国传统中药人参（红参）中微量提取的中药单体抗癌成分，从其发现到开发研究也仅有二十余年的历史［1，2］。实验表明人参皂苷Rg3能够抑制肿瘤细胞增殖、浸润及转移，及提高机体免疫等作用［3，4］。目前传统中药的研究多限于组方疗效的验证和对免疫功能的影响。在细胞凋亡、肿瘤新生血管生成方面研究较少。本实验采用具有高淋巴道转移特性的瘤株Hca-F25//6A3-F(F)接种于615近交系小鼠，建立动物转移模型［5］，合理配伍，并通过电镜及流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡，并应用免疫组化方法检测VEGF的表达。现报道如下。
       　　1  材料与方法
       1.1  实验动物及瘤源615近交系小鼠，普通级，6～8周龄，体重22～24 g，雌雄兼有；肝癌Hca-F25//6A3-F(F)瘤株由大连医科大学病理教研室建株和提供。
       1.2  试剂人参皂苷Rg3纯品由大连富生天然药物研究所提供；顺铂（PDD）为锦州九泰药业产品；浓缩型Sp免疫组化试剂盒购自北京中山试剂公司；鼠抗鼠VEGF单克隆抗体购自武汉博士德试剂公司。
       1.3  荷瘤小鼠的制备取肝癌Hca-F25//6A3-F系冻存细胞复苏，接种于615系小鼠腹腔，收集第二代腹水细胞（细胞存活率在95%以上），接种于615系小鼠的右足垫，每只0.2ml（细胞数约2×106个/ml）。15 d后截去右足瘤体，保留样品；继续给药5 d，5 d后动物处死，留取样品。
       1.4  实验分组及处理将615近交系小鼠分为5组，每组13～15只。实验分组如下：人参皂苷Rg3预防组(于实验前7 d开始给Rg3，15只)； Rg3治疗组(13只)；阳性对照组(PDD，14只)；联合治疗组 (Rg3+ PDD，15只)：阴性对照组 (生理盐水，14只)。 Rg3用法为：3mg/kg，灌胃1次/d，治疗组连续24 d；预防组共31 d。PDD的用法为：1 mg/kg，隔日腹腔灌注，12次。联合治疗组Rg3+PDD的用法：方法与各药一致。生理盐水每天灌胃1次，连续24 d。于接种肿瘤后第25天断头处死小鼠，取血；取原发瘤及右窝腹股沟处淋巴结（含转移瘤）组织。
       1.5  电镜观察及流式细胞仪检测  取原发瘤和转移瘤组织后，将瘤组织切割成1 mm3大小的碎块，放于2%戊二醛中前固定，俄酸后固定，乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋、渗透、加温聚合，超薄切片机上切片，厚度为1 μm，在扫描电子显微镜下观察并成像，观察细胞坏死和细胞凋亡的形态学变化。将待进行流式细胞学分析的原发瘤和转移瘤组织（每个实验组随机选择5个配对样品）研磨后，用300目沙网过滤，滤液于1640培养基中, 37℃培养1 h。经95%乙醇固定24 h后，应用于流式细胞仪（DD-B公司，USA））检测。
       1.6  VEGF免疫组化过程石蜡HE切片，选择合适腊块，切片，脱腊、逐级水化，3%H2O2-甲醇（临用前现配）消化内源性过氧化物酶15 min；VEGF用胰酶消化修复，0.5%小牛血清蛋白封闭非特异性抗体；加入一抗（稀释倍数为1∶150）；加入生物素化的小鼠二抗；加入辣根过氧化物酶-链霉菌卵白素；加DAB显色；脱水、二甲苯透明；加拿大中性树胶封片。
       1.7  VEGF结果判定方法染色强度根据着色的强弱依次分为阴性（<5%），阳性+，++，+++；染色面积分为<25%，25%~50%，50%~75%，>75%。染色强度（阳性为有意义：+：1；++：2；+++：3）*染色面积（<25%：1；25%~50%：2；50%~75%：3；>75%：4）之值输入SPSS8.0软件中与阴性对照组行方差分析。
       1.8  统计学方法应用SPSS12.0软件，VEGF表达情况为计数资料应用±s，各组与阴性对照组进行配对t检验，P<0.05为统计学差异。
       　　2  结果
       2.1  原发瘤和转移瘤组织的电镜分析实验结果显示：人参皂苷Rg3预防组及治疗组在多个视野下可见染色质固缩，并向核周集聚，形成典型的细胞凋亡小体（图1：电镜照片，×8 000）；同时，可观察到部分细胞内有线粒体结构的改变，如线粒体皱缩等；顺铂治疗组的细胞形态改变以细胞破坏为主（图2：电镜照片，×5 000），染色质向核中间集聚，肿胀的线粒体较多，偶见细胞凋亡小体；Rg3与顺铂联合治疗组的细胞则出现细胞内的染色质既有向中间集聚的，也有向核周集聚的（图3：电镜照片，×5 000）；阴性对照组含有较多细胞核增大的肿瘤细胞，基质弥散，未见细胞凋亡小体（图4：电镜照片，×5 000）。
       图1  电镜照片（×8000)（略）       
       图2  电镜照片（×5000)（略）
       图3  电镜照片（×5000)（略）       
       图4  电镜照片（×5000)（略）
       2.2  流式细胞学分析对原发瘤和转移瘤组织进行的流式细胞学检测结果显示：Rg3预防组、Rg3治疗组、联合治疗组在5个样品中均可见特征性的细胞凋亡峰（5/5），顺铂治疗组仅有1个样品出现细胞凋亡峰（1/5），阴性对照组未见细胞凋亡峰（0/5）。人参皂苷Rg3抗肿瘤生长主要作用于细胞G2期，S期不活跃（图5）。
       2.3  VEGF免疫组化结果（图6：放大200倍，阳性结果为细胞浆呈棕黄色染色）人参皂甙Rg3预防组、治疗组、PDD及两药合用组均引起VEGF分泌减少，但仅人参皂苷Rg3预防组在原发瘤中使VEGF分泌减少与阴性对照组有统计学差异。
       图5  流式细胞学分析（略）       
　　
　　图6  电镜照片（放大200倍）（略）
       表1  VEGF在各组中的表达（略）
       　　3  讨论
       肿瘤的生长和转移是一个复杂的，与机体多种病理过程有关，目前认为肿瘤的生长与肿瘤细胞不能程序化死亡有关，且肿瘤的生长需要血液供应营养［5］。本实验所用的为Hca-F25//6A3-F(F) 肝癌瘤株，前期实验已证实对淋巴管有极强的黏附能力［6］，无论经腋窝下、足垫，还是血道接种于615系小鼠近交系小鼠，均可特异的向淋巴道转移。本实验中采用的是足垫接种方法，其局部淋巴管引流线路明确，便于择时进行局部手术（待阴性对照组绝大部分可触及有邻近淋巴结转移时）。这不仅减轻了局部的荷瘤量，更接近于临床肿瘤病理的进展过程，且不易引起压迫症状，并发症少，术后尚可继续观察肿瘤生长及转移情况。本实验结果显示人参皂苷Rg3具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的作用。细胞凋亡是指细胞的程序化死亡，是机体维持细胞结构、功能正常及细胞数量动态平衡的一种重要调节机制；而肿瘤细胞的异常变化之一是凋亡的肿瘤细胞数量降低。判断细胞发生凋亡的形态学特征为：染色质固缩，向核周移动，核膜崩溃及形成凋亡小体等［7~9］。凋亡细胞在被诱导产生特征性DNA降解和形态学改变之前，有一个不可逆的线粒体膜结构和功能改变，包括线粒体皱缩、内膜跨膜电位消失、通透性转换孔打开和线粒体内活性蛋白酶产物释放等。本研究结果显示，在原发瘤及转移瘤中，人参皂苷Rg3预防组、治疗组及联合治疗组中，发生凋亡的肿瘤细胞数目增加，均观察到细胞凋亡的形态学变化并检测到细胞凋亡峰，人参皂苷Rg3抗肿瘤生长主要作用于细胞G2期。提示人参皂苷Rg3有促进处于肿瘤发生不同阶段的细胞凋亡作用，对肿瘤的复发和转移的治疗有积极的意义。血管内皮生长因子（Vescular endothelial growth factor,VEGF）是内皮细胞的特异性有丝分裂原，它对于血管形成及血管通透性具有诱导作用［11，12］。在肿瘤形成早期，VEGF可诱导内皮细胞产生组织因子和基质金属蛋白酶，使凝血酶原转化为凝血酶，从而激活明胶酶原A降解原来的基膜，使细胞增殖。本实验人参皂苷Rg3及PDD均引起VEGF分泌减少，但仅人参皂苷Rg3预防组使VEGF分泌减少与阴性对照组有统计学差异，这与接种的瘤细胞一次性量大、细胞活性强，自身分泌的血管内皮生长因子多，用药后亦不易控制有一定关系。同时说明长期应用人参皂苷Rg3能够降低VEGF表达。本实验为系列实验，其他实验表明：人参皂苷Rg3抑制淋巴道转移机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡及降低细胞增殖核抗原（PCNA）、金属蛋白酶（如MMP2、MMP9）、增加抑癌基因P16表达，从而抑制了瘤内血管内皮细胞因子的分泌，阻断了瘤细胞之间及瘤细胞与细胞外间质的特异性粘连；降低了瘤细胞对细胞外间质和其基底膜的降解能力等相关［13~15］。
       　　参考文献：
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       (大连市中医医院，辽宁 大连  116013；  大连医科大学附属第一医院，辽宁 大连  116011；大连医科大学附属第二医院，辽宁 大连  116011)