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       【关键词】  复方二精灵
       摘要：目的：研究复方二精灵多糖抗脑缺血损伤的分子机理。方法：采用全细胞膜片钳技术记录急性分离的小鼠海马CA1区神经元电压门控性钠电流，观察复方二精灵多糖对钠电流的影响，拟从离子通道水平揭示复方二精灵的抗缺血缺氧脑损伤作用。结果：0.1%复方二精灵多糖显著抑制海马神经元电压门控性钠通道电流锋值，使钠电流的半激活电压向去极化方向偏移，不影响钠电流的稳态失活及复活曲线。结论： 复方二精灵多糖对海马神经元电压门控性钠电流的抑制作用可能为复方二精灵抗缺血缺氧脑损伤的重要机理。
       关键词：复方二精灵；海马神经元；电压门控性钠通道
       The Molecular Mechanism of Compound Erjingling Polysaccharide Neuroprotection Effect on Hypoxia and Ischemia Damage
       YIN Shijin，LIU Xiangming，WU Qunrong，MEI  Zhinan
       (1.The Biomedical Engineering Institute of Centralsouth University for Nationalities,Wuhan  430074, China; 2.Institute of Nationality Materia Medica, Central-south University for Nationalities, Wuhan 430074,   China）
       Abstract:Using wholecell patch clamp technology on the membrane of freshly isolated hippocampal neurons , the effects of Compound Erjingling polysacharide on voltagegated sodium currents were observed to investigate its molecular mechanism of neuroprotection in hypoxia and ischemia damage. The experimental data demonstrated that peak sodium currents of hippocampal neurons decreased significantly after application of  0.1% Compound Erjingling polysaccharide (from 100% to 60.96± 12.13%, n=16，P<0.05). The half-maximum activation voltage of INa shifted from29.98±4.30mV to 15.85±2.9mV after administering 0.1% Compound Erjingling (n=6, P<0.05). The inhibition effects of Compound Erjingling polysaccharide on sodium currents in hippocampal neurons could partly explain the neuroprotection of Compound Erjingling in hypoxia and ischemia damage.
       Key words:Compound Erjingling polysaccharide；voltage gated sodium channel；Hippocampal neuron
       复方二精灵是由枸杞子（Fructus  Lycii）和黄精（Rhizome of King Solom Oseal）组成，最早收载于《圣济总录》，具有“助气固精，补填丹田，活血驻颜，长生不老”之功效。现代研究证实复方二精灵可拮抗谷氨酸对离体培养神经细胞的兴奋性毒作用，明显降低缺血缺氧小鼠脑组织乳酸含量，使海马细胞变性及肿胀程度减轻，从而改善拟痴呆小鼠的学习记忆能力［1］。复方二精灵成分复杂，种种迹象表明复方二精灵中的黄精多糖［2］和枸杞多糖［3］是其抗缺血缺氧脑损伤的重要活性部位，但因缺乏分子水平的合理解释，制约了复方二精灵的临床使用。由于缺血缺氧过程中神经细胞变性损害与神经细胞膜上电压门控性钠通道介导的钠离子内流增强有关［4］，多种药物正是通过阻滞神经细胞膜上电压门控性钠通道而发挥脑保护作用［5，6］。在所有脑神经元中，海马神经元对缺血缺氧最为敏感［7］，海马组织也是学习记忆功能的关键脑区［8］，能否有效减轻海马神经元损伤成为缺血缺氧过程中脑保护的关键。鉴于此，本研究主要观察复方二精灵多糖对急性分离的小鼠海马神经元电压门控性钠通道的影响作用，拟从分子水平揭示其在缺血缺氧过程中的脑保护作用。
       　　1 材料与方法
       1.1 复方二精灵多糖的制备取黄精和枸杞各50 g，混匀。依次用5倍体积石油醚-丙酮（V/V 1∶1）回流脱脂，5倍体积 80％乙醇(V/V)脱单糖、低聚糖等杂质，然后用1 000 ml热水提取3次，水提取液合并，60℃减压浓缩至1.5倍体积，浓缩液以95％乙醇沉淀，至乙醇浓度为80％，沉淀2次，沉淀物依次用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤脱水，60℃真空干燥得粗多糖7.30g。 复方二精灵多糖含量用硫酸-苯酚法490 nm处检测，其含量为80.8％。
       1.2 海马神经元的急性分离一月龄昆明种小鼠（15～20 g，武汉大学实验动物中心提供）颈椎脱臼处死，断头取脑于4℃的D-hanks液中冷冻1 min后移入氧饱和的ACSF液中分离双侧海马。在32℃的恒温水浴摇床中孵育海马40 min后加入0.2 ｍｇ/ml链酶蛋白酶E (proteaseⅩⅣ, Sigma) 消化20 min，在解剖显微镜下用细解剖针将海马ＣＡ1区分割下来并移入氧饱和的DMEM/F12培养液中，用尖端热抛光处理的吸管(口径依次为 500，300和 150 μｍ)将之吹打成细胞悬液。将细胞悬液经200目筛网过滤至直径35 mm的培养皿内，待细胞贴壁后更换外液两次，行全细胞膜片钳记录。实验在室温22～25℃范围内进行。
       1.3 记录液及实验用药记录海马神经元电压门控性钠通道电流的细胞外液成分为(mmol/L)：NaCl 145.0；KCl 5.0；CaCl2 2.0；MgCl2 1.0；HEPES 10.0；DGlucose 10.0；4AP 1.0；Cl-TEA 20.0，pH 7.4。记录钠通道电流的细胞内液成分为（mmol/L）： CsCl 100.0；KF 40.0；CaCl2 1.0；MgCl2 2.0；EGTA 10.0；HEPES 10.0；Na2ATP 5.0；ClTEA 20.0，pH 7.2。以上所用药物中4AP ，EGTA，HEPES，ClTEA及Na2ATP为Sigma公司产品，其它为国产分析纯。实验过程中所用药物复方二精灵多糖用细胞外液配制成0.1%的浓度。
       1.4  全细胞膜片钳记录应用EPC9双通道膜片钳放大器（HEKA公司，Germany）行全细胞膜片钳记录。仅选用形态为锥形或梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进行全细胞膜片钳记录观察钠通道电流。在电极与细胞膜之间形成高阻(1～5G)封接后，负压破膜，并给予适当的电容补偿，在设定的刺激电压下，观察钠电流的激活情况。先观察正常钠电流，再经DAD给药系统（ALA，USA）向细胞喷射0.1%的复方二精灵多糖，记录给药后的钠通道电流。
       1.5 实验资料的处理实验资料经plusefit软件及IGOR软件进行分析处理，实验数据用±s表示。对各组数据分别进行t检验，以P<0.05作为显著性检验的标准。
       　　2  结果
       2.1 复方二精灵多糖对海马神经元电压门控性钠通道锋电流的影响在90 mV的钳制电位下，从60 mV起给予10 mV步幅递增、80 ms步宽的去极化脉冲刺激至+60 mV，分别激活并记录给药前后海马神经元钠通道电流。本研究以单纯的外液冲洗对海马神经元电压门控性钠电流的影响为对照，考察0.1%复方二精灵多糖给药前后海马细胞钠通道电流峰值的改变情况。具体做法是设置外液冲洗（给药）前钠电流峰值为100%，按照公式［冲洗（给药）后Imax/冲洗（给药）前Imax］×100%对外液冲洗（给药）后所记录的海马细胞钠电流峰值进行标准化。结果发现单纯外液冲洗即刻使海马细胞钠电流峰值略微增加至冲洗前的(111.62±14.35)%，而0.1%复方二精灵多糖给药即刻使海马细胞钠电流峰值明显减少至给药前的(60.96±12.13)%。与单纯的外液冲洗相比，0.1%复方二精灵多糖给药即刻显著抑制海马细胞钠电流峰值 (n=16，P<0.05)。
       2.2 复方二精灵多糖对海马神经元电压门控性钠通道激活、失活及复活动力学特性的影响 将膜电位钳制在90 mV，从60 mV起给予10 mV步幅递增、80 ms步宽的去极化脉冲刺激至+60 mV，引出钠通道电流(图2A)。以测试电压为横轴，测试电压所对应的标准化电流值为纵轴，绘制给药前后电流的稳态激活曲线，钠电流的稳态激活曲线用Boltzmann方程拟合得出海马神经元钠通道给药前后的半激活电压值(Ｖ1/2)：I/Imax=1/{1+exp［(V-V1/2)/k］}。(Ｉ表示测试电压所对应的钠电流峰值，Ｖ1/2表示50％最大激活时所对应的测试电压, k为曲线的斜率)。结果表明0.1%的复方二精灵多糖显著改变了海马神经元稳态激活曲线（图2a），使半激活电压由给药前的(29.98±4.30)mV去极化偏移至(15.85±2.9)mV（P<0.05, n=16）。
       将膜电位钳制在90 mV，采用双脉冲刺激方法观察钠通道的稳态失活情况，即先给予10 mV步幅递增、30 ms步宽、90 mV～-20 mV的条件刺激电压，每一条件刺激后紧跟一30 ms步宽、20 mV的测试电压刺激(图2b)。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Imax对条件刺激电压作图绘制稳态失活曲线，也用Boltzmann方程拟合得出海马神经元钠通道给药前后的半失活电压值(Ｖ1/2)：I/Imax=1/{1+exp［(V-V1/2)/k］}。(Ｉ表示测试电压所对应的钠电流峰值，Ｖ1/2表示50％最大激活时所对应的测试电压,k为曲线的斜率)。结果发现，0.1%的复方二精灵多糖给药前后海马神经元稳态失活曲线没有明显改变〔(55.42±0.75)mV vs(53.52±0.88)mV, P>0.05, n=6)〕（图2 b）。
将膜电位钳制在90 mV，采用双脉冲刺激方法观察钠通道失活后的恢复情况，即在每一条件刺激电压后都施加一测试电压刺激，条件刺激电压和测试电压的宽度均为30 ms，两次刺激的时间间隔从2 ms开始，以2 ms等差递增至36 ms，条件刺激电压和测试电压均为20 mV（Fig 2C）。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Imax对时间间隔t作图绘制失活后的恢复曲线，并用单指数函数拟合曲线，得出钠通道给药前后失活后恢复的时间常数（ τ）：I(t)/Imax=A0+A1etτ。t为条件刺激电压和测试电压之间的时间间隔， I(t)表示测试电压所对应的钠电流峰值， τ为失活后恢复的时间常数。结果发现，0.1%的复方二精灵多糖给药前后海马神经元稳态复活曲线没有明显改变(图2c)，给药前半复活时间常数为(6.21±0.27) ms ，给药后为(7.38±0.42)ms（P>0.05, n=6）。
       　　3 讨论
       海马组织是哺乳动物学习记忆形成的关键脑区，也是缺血缺氧易损区域，海马组织的损害会引起学习和记忆功能受损［7，8］。目前认为细胞内钙离子浓度的增加是急性脑缺血缺氧引起海马细胞死亡的重要原因［9］，因为细胞质内Ca2+浓度的增高,可继发线粒体内钙积聚，继而可出现线粒体膜通透性增加，大量氧自由基产生并释放，最终线粒体损坏致细胞能量供应障碍，引起细胞死亡［10］。导致缺血缺氧时神经细胞内钙浓度增加的原因很多，而其中神经细胞膜电压依赖性钠通道介导的钠内流增强与细胞内钙超载关系尤为密切，钠内流增强引起细胞内钠离子浓度升高，细胞膜及线粒体膜上Na+/Ca2+交换相应增强，导致细胞质中游离Ca2+的增加［4］。正因为神经细胞膜上电压门控性钠通道在缺血缺氧时细胞内钙超载发生中的重要地位，大量的研究工作也试图去证实钠通道阻滞药在脑缺血缺氧过程中的神经保护作用。实际上多种药物也正是通过阻滞神经细胞膜上电压门控性钠通道而发挥缺血缺氧过程中的脑保护作用的［5~10］。所以阻断Ｎａ+通道是近年抗脑缺血缺氧损伤药物研发中的一个研究热点。
 
　　黄精和枸杞为祖传名贵益智中药。现代药理学实验也证实了黄精［11］、枸杞［12］具有良好的抗衰老、改善痴呆症状的作用。黄精、枸杞的益智作用与其在缺血缺氧过程中的脑保护作用有关［13，14］，其中黄精多糖和枸杞多糖是它们抗缺血缺氧损伤的重要活性部位［2，3］。复方二精灵为等量黄精、枸杞配伍提取而成，最近的研究报道指出复方二精灵对体内外缺血缺氧损伤模型中的神经细胞均有明显的保护与改善作用，这可能是复方二精灵改善学习记忆的重要原因［1］。然而复方二精灵在脑缺血缺氧过程中的神经保护作用尚缺乏分子水平的合理解释，制约了该药的临床应用。考虑到在复方二精灵的多种组分中，黄精多糖和枸杞多糖是其抗缺血缺氧脑损伤的重要活性部位，本研究利用现代膜片钳实验技术，在急性分离的小鼠海马细胞膜上观察了复方二精灵多糖对电压门控性钠通道的影响。结果发现复方二精灵多糖可显著抑制急性分离的海马神经元电压门控性钠通道电流锋值，使钠通道半激活电压向去极化方向偏移。根据本实验研究结果结合其他的研究报道，本课题组认为复方二精灵改善急性脑缺血缺氧所致记忆障碍的机理之一为其多糖组分抑制海马细胞电压门控性钠通道，有效阻止了海马细胞内钙积聚，在一定程度上减弱了海马细胞内钙超载所致海马细胞损伤。由于本研究所使用的药品为复方二精灵的多糖组分，其对海马细胞电压门控性钠通道的抑制作用是多种成分共同作用的结果还是某单一成分的效应尚有待进一步的研究。
       　　参考文献：
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　　作者简介：尹世金(1974)，男(汉族)，湖北南漳人，现任中南民族大学生物医学工程研究所讲师，硕士学位，主要从事神经电生理研究工作.
       通讯作者简介：梅之南(1971)，男(汉族)，湖北黄石人，现任中南民族大学民族药物研究所副教授，博士学位，主要从事中药药理学研究工作.
       (1.中南民族大学生物医学工程研究所，湖北 武汉430074；2.中南民族大学民族药物研究所，湖北 武汉430074)
       收稿日期：20050509；