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       【关键词】  吴茱萸；,,生物碱；,,指纹图谱,
       摘要：目的以吴茱萸碱和吴茱萸次碱为对照品建立吴茱萸生物碱类的高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱，为鉴定吴茱萸药材提供依据。方法色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)。流动相：乙腈水梯度洗脱，梯度0~5 min水80%，5~25 min水80%~35%，25~55 min水3 5%~0，55~60 min水0。 检测波长225 nm，柱温25℃，进样量10 μl。结果测定的20批吴茱萸样品有11个共有峰，共有峰相对保留时间的RSD为1.2％ ～2.5％，相对峰面积的RSD为2.3%~3.5%。结论该实验首次建立了中药吴茱萸中生物碱成分的HPLC指纹图谱，为不同产地和采收期的吴茱萸药材鉴别提供了科学依据。
       关键词：吴茱萸；  生物碱；  指纹图谱 
       Fingerprint Study on Alkaloid in Fructus Evodiae
       ZHANG Min，YUAN Jinbin，HUANG Jialong，HUANG Xingfa ，WANG Huijun
 
　　(Key Laboratory of Modern Preparation of TCM , Ministry of Education ,Nanchang 330004,China； Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006 ,China)
       Abstract：ObjectiveEvodiamine and Rutaecarpine were used as reference substances to establish an HPLC fingerprint of alkaloid in Fructus Evodiae for identifying and evaluating its quality．MethodsThe alkaloid was separated on a Diamosil C18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm).The mobile phase consisted of acetonitrile and distilled water with gradient elution．The flow rate was 1.0 ml/min. The wavelength of UV detection was 225 nm．The column temperature was 25℃ and 10 μl was injected．ResultsThere were 11 common peaks in the fingerprint of 20 samples．The RSD of the relative retention time of the common peaks was 1.2%~2.5%.The RSD of the relative peak area was 2.3%~3.5%．ConclusionThe fingerprint of alkaloid in Fructus Evodiae was firstly established,and it was proved to be scientific and effective .It will be used to identify the quality and evaluate different origins and collection period of Fructus Evodiae.
       Key words：Fructus Evodiae；  Alkaloid；  Fingerprint
   
　　吴茱萸为常用中药，始载于《神农本草经》，具有散寒止痛，降逆止呕、助阳止泻的功效。原药材来源于芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth，石虎Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth．var．officinalis (Dode) Huang 或疏毛吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss．) Benth．var．bodinieri(Dode) Huang 的干燥近成熟果实。吴茱萸的有效成分主要为生物碱［1］和柠檬苦素［2］，而不同产地和采收期的药材其有效成分的含量存在较大差异，因此对其质量进行控制非常重要。但是现在基本还是用传统的性状鉴别和显微鉴别确定真伪，以理化鉴别区别优劣。这些方法需要经验的积累因此受人为因素影响较大。本实验采用RP-HPLC法对吴茱萸中的生物碱成分进行研究，通过科学系统的实验建立了一个有效的指纹图谱方法，为不同产地和采收期的吴茱萸药材的鉴定提供了依据。
       　　1  仪器与试药
       Agilent 1100型高效液相色谱仪（包括：柱温箱，MWD检测器和Agilent 1100 色谱工作站）；超声波清洗器（浙江昆山，KQ318型，2.5kw）；Mettler AE240电子天平。吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品购于中国药品生物制品检定所（供鉴别用），经纯化后，HPLC面积归一化法计算纯度分别为98.12%和98.33%。甲醇、乙腈（HPLC级，Merk公司），水为重蒸馏水，其它试剂为分析纯。吴茱萸于20040912由江西遂川翔云GAP基地(15份)提供，其它产地样品为自己采集或市售品，经过江西中医学院中药鉴定学刘庆华教授鉴定为正品吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth。
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱条件的优化
       2.1.1  色谱条件Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水梯度洗脱；柱温25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：225 nm；进样量：10 μl。
       2.1.2  流动相的选择经过实验比较后发现，水溶液与乙腈溶液的梯度洗脱能使样品中各色谱峰较好的分离，而且相比其他流动相能够洗脱较多物质出峰很多，分析时间为60 min，样品2 h色谱图显示60 min后无特征峰出现，梯度洗脱表见表1。
       表1  梯度洗脱（略）
       2.1.3  检测波长的确定采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，记录并比较不同波长的色谱图，结果在225 nm检测波长下，色谱图中色谱峰较多，信息丰富。故选择225 nm为检测波长。
       2.2  溶液制备
       2.2.1  对照品溶液的制备精密称取吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品适量，加甲醇溶解配制成适宜浓度,分别进样10 μl,色谱图见附图1~3。
       图1  吴茱萸碱对照品的HPLC-FP图（略）
       图2  吴茱萸次碱的HPLC-FP图（略）
       图3  混标的HPLC-FP图（略）
       2.2.2  供试品溶液的制备称取吴茱萸药材0.20 g，精密称定，置于25 ml容量瓶中,准确加入25 ml甲醇称重，超声45 min，称重，加入甲醇补足重量，过滤，取续滤液，分析前用0.45 μm滤膜过滤。
       2.3  方法学考察
       2.3.1  精密度实验 精密称取吴茱萸药材1份，按供试品溶液制备方法操作，连续进样6次，记录其指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，其相似度均大于0.96，表明供试品进样精密度良好。
       2.3.2  重现性实验 精密称取同1份吴茱萸药材6份，按供试品溶液制备方法操作，分别进样，记录其指纹图谱。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算，结果相似度均大于0.94，表明本法测定的重现性良好。
       2.3.3  稳定性实验 精密称取吴茱萸药材1份，按供试品溶液制备方法操作，分别在0，2，6，9，11，14，17，20，24 h检测，记录其指纹图谱。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算，结果相似度均大于0.92，表明供试品在测定的24 h内保持稳定。
       2.4  吴茱萸药材指纹图谱的建立取吴茱萸GAP种植基地不同批次的和5个不同产地的吴茱萸供试品共20份，按照2.2.2方法制备供试品溶液，进样并记录色谱图，根据20批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关参数，进行分析、比较，制定优化的指纹图谱，结果见图4~5。
       2.5  指纹图谱分析与评价
       2.5.1  吴茱萸HPLC可分离出30多个色谱峰，经比较选择11共有峰作为构建指纹图谱的特征峰，其保留时间和峰面积见表3。
       2.5.2  共有指纹蜂标定 根据20批次供试品测定结果，标定共有指纹峰。吴茱萸HPLC指纹图谱中，共有指纹峰11个。以供试品中吴茱萸碱的共有指纹蜂作为参照，与参照峰相比，其它10个共有指纹峰相对保留时间和相对峰面积见表4。
       图4  吴茱萸供试品的HPLC-FP图（略）
       图5  10批吴茱萸药材HPLC-FP重叠图（略）
       表2  共有峰信息色谱（略）
       表3  指纹图谱分析结果（略）
       比较各个样品共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积比值变化范围不大，稳定性强，可作为其指纹信息特征。
       　　3  讨论 
       3.1  本实验采用甲醇超声提取吴茱萸中生物碱，以吴茱萸碱和吴茱萸次碱作对照品，进行指纹图谱分析，该方法供试品制备简单，出峰多，各个峰之间的分离度较好，重现性很好，可信度高，可以推广。
       3.2  通过对20个色谱图进行相似度分析发现：由于吴茱萸的产地不同其相似度有很大差别，GAP种植基地的药材相似度较高均在0.91以上，但是各产地的药材与之比较相似度在0.65~0.75左右，由此可以区别来源不同的吴茱萸药材。
       3.3  近年来广大研究者对吴茱萸化学成分和药理作用研究的较多［3，4］，但却很少有报道吴茱萸指纹图谱研究的，除了河北北方学院的甄攀等［5］对吴茱萸水溶性成分的指纹图谱进行研究外迄今未见此类的报道。由于药理实验表明，吴茱萸的有效成分主要为生物碱类，因此对吴茱萸的生物碱类成分的指纹图谱进行研究意义深远。本实验首次建立了吴茱萸中生物碱类成分指纹图谱分析的方法，通过该方法可以区别不同产地和采收期的吴茱萸。
       　　参考文献：
       ［1］  李明道，黄和义.石虎的化学成分研究［J］.药学学报，1966，13(4)：265.
       ［2］  刘蕴秀，罗淑荣.吴茱萸中生物碱成分的研究新进展［J］.天然产物研究与开发，1998，12（1）：87.
       ［3］  胡长平，李元建.吴茱萸碱和吴茱萸次碱的药理学研究进展［J］.中国药理学通报，2003，19(10)：1084.
       ［4］  戴媛媛，刘保林，窦昌贵.吴茱萸及其有效成分的药理研究进展［J］.中药材，2003，26(4)：295.
       ［5］  甄  攀，张万明，白雪梅.吴茱萸水溶性成分指纹图谱研究［J］.中国药学杂志，2005，40（6）：411.
       (现代中药制剂教育部重点实验室・江西中医学院，江西 南昌  330004；江西中医学院，江西 南昌  330006)