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       【关键词】  黄芪多糖；,,人参总皂苷；,,淋巴细胞
       摘要：目的观察1年生栽植黄芪中黄芪多糖（APS1）及其与人参总皂苷(TG)联用时对人外周T细胞(hPBTCs)的增殖的影响。方法采用MTT比色法检测hPBTCs的增殖。结果APS1在25～100μg/ml范围内，TG在5～20μg/ml范围内均促进hPBTCs的增殖，增殖百分率分别为127.8%～144.6%和113.9%～163.1%，APS1与TG在上述浓度范围内联用时, 增殖百分率为309.5%～529.5%。结论 APS1明显促进体外培养的hPBTCs增殖，APS1与TG联用可能增加免疫功能,并具有一定的协同作用。
       关键词：黄芪多糖；  人参总皂苷；  淋巴细胞
       Effect of Polysaccharide from the Annual Astragalus on the Proliferation of Human Peripheral T Lymphocytes
       ZHANG Shanyu,   SHI Suyun, PIAO Huishun, JIN Zaijiu
       （Key Laboratory of Natural Resources of the Changbai Mountain and Functional Molecules (Yanbian University), Ministry of Education, Yanji, Jilin 133000, China; College of Pharmacy, Yanbian Medical University，Yanji, Jilin 133000，China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of polysaccharide from the annual Astragalus （APS1 ）and combination with total ginsenoside (TG) on the proliferation of human peripheral T lymphocytes (hPBTCs) . MethodsBy MTT colorimetric analysis, the proliferation of hPBTCs was detected. ResultsThe proliferation of hPBTCs was promoted by both APS1(25~100 μg/ml) and TG. (5~20 μg/ml); the percentage of proliferation were 127.8%～144.6 % and 113.9%~163.1% ,respectively; the percent of proliferation was 309.5%～529.5% while APS1 combined with TG in each concentration range. ConclusionThe APS1  can stimulate proliferation of hPBTCs in vitro and the combination of APS1 and TG can promote immune function.
       Key words：Astragalus polysaccharide;  Total ginsenoside；  Lymphocyte
   
　　黄芪多糖(APS)为黄芪的主要有效成分，近年来许多学者从不同角度对其进行了研究，结果表明APS具有很好的免疫调节作用［1］。不同生长年限黄芪中均含有黄芪多糖，而1年生栽植黄芪中黄芪多糖（APS1）的含量较高［2］。为了探讨APS1的生物活性，本文研究了APS1及其与人参总皂苷(TG)联用对人外周T细胞增殖反应的影响。现将结果报道如下。
       　　1  材料
       RT-2100C型酶标仪（美国Rayto公司）；TC2323型CO2培养箱（美国Sheldon Manufacturing公司）；LDZ52型离心机（北京医用离心机厂）；透析袋（1200014000，华美生物工程公司北京分公司）；1年生栽植黄芪(于200310末采集于吉林省和龙市,由吉林省延边大学医学院生药学教研室吕惠子副教授鉴定为膜荚黄芪Astragalus membraneaceus Fisch.)；人参总皂苷(吉林省宏久生物技术有限公司)；四甲基偶氮唑盐（MTT）（华美生物工程公司北京分公司）；植物血凝素（PHA）（广州市医药工业研究所）；环磷酰胺（CY）（江苏恒端医药股份有限公司）；二甲基亚砜（DMSO) 等其他试剂均为分析纯。
       　　2  方法
       2.1  APS1提取 称取干燥粉碎的1年生载植黄芪药材300 g，加水（20，10，10倍），80℃温度条件下提取3次（2，1，1 h），过滤，滤液浓缩至约500 ml,加95％乙醇至醇度达80％，放置过夜，沉淀加水溶解，过滤，经Sevag法［3］除蛋白7次，用氨水调pH至8，加3％过氧化氢后放置37℃水浴12 h,过滤，滤液置透析袋中流水透析12 h,液体浓缩再醇沉，放置过夜，沉淀用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥，得7.2 g类白色粉末状粗多糖（多糖含量为 78.3％）。
       2.2  对人外周T细胞增殖反应（MTT法）［4］
       2.2.1  实验分组实验共设10个组，①APS1 1组：APS1 25 μg/ml；②APS1 2组：APS1 50 μg/ml；③APS1 3组：APS1 100 μg/ml；④TG 1组：TG 5μg/ml；⑤TG 2组：TG 10μg/ml；⑥TG 3组：APS1 20μg/ml；⑦联用1组：APS1 25 μg/ml + TG 5μg/ml；⑧联用2组：APS1 50 μg/ml + TG 10μg/ml；⑨联用3组：APS1 100 μg/ml + TG 20μg/ml；⑩对照组：生理盐水。
       2.2.2  T细胞增殖反应取正常人抗凝外周血30 ml，按常规分离淋巴细胞，用完全培养液调整细胞的密度为1×106/ml，台盼蓝染色检测细胞存活率>95％。取100 μl加入96孔细胞培养板中，加入终浓度为10 μg/ml的PHA，并按实验分组加入ASP1，TG溶液或生理盐水（同时每组分别以培养液代替细胞液作为空白对照），每组设3个复孔，置37℃,5%CO2培养箱中培养。48 h后，每孔加入MTT溶液（5 g/L）10 μl，继续培养4 h，离心，弃上清液，加入DMSO 150 μl,充分振荡后静止20 min，用酶标仪于波长490 nm处测定吸光度值，结果以4个复孔的平均吸光度值A490 nm（实验组A490 nm = A490 nm加供试品组－A490 nm空白对照）和细胞增殖百分率表示（细胞增殖百分率＝实验组A490 nm/对照组A490 nm×100％）。
       2.3  统计分析实验数据以 ±s表示，用两样本均数比较t检验进行统计学处理。
       　3  结果
       用MTT法测定结果，正常人外周T细胞在PHA激活的条件下，APS1，TG和APS1＋TG各浓度组的淋巴细胞光密度值A490 nm与增殖百分率均较生理盐水组有增高的趋势，其中TG的作用随着浓度的提高而增强，APS1 的各浓度组均作用较强，但APS1的药效与浓度没有依赖关系 。APS1＋TG各浓度组增殖百分率均高于单用APS1或TG组，APS11组、 APS12组、TG3组及APS1＋TG各组的A490 nm明显高于生理盐水组（P<0.05或P<0.01），结果见表1。
       表1  APS1和 TG联用对T细胞增殖的影响（略）
       与生理盐水组比较，*P< 0.05，** P< 0.01
       4  讨论
       本实验结果表明，APS1在25～100 μg范围内，TG在25～100 μg范围内均促进hPBTCs的增殖；APS1和TG在上述浓度范围内配伍时，增殖百分率大于单用APS1和TG时的增殖百分率之和，提示APS1具有促进体外培养的hPBTCs增殖的作用， APS1与TG配伍时在T淋巴细胞增殖方面具有协同作用。随着对黄芪多糖研究的不断深入，人们逐渐发现黄芪多糖对免疫系统、机体物质代谢系统、造血及心血管系统有积极的影响，还具有保肝护肾、抗病毒、抗肿瘤和抗应激等作用［5］，尤其是黄芪多糖显著的免疫调节和抗肿瘤作用更日益引起医药界广泛关注。无论在人，还是在动物，黄芪多糖都将得到更广泛的利用。黄芪多糖在临床应用和预防治疗肿瘤方面具有潜在的应用前景。本实验证实1年生栽植黄芪中含有较高的黄芪多糖（32.12 mg/g），并促进体外培养的hPBTCs增殖，1年生黄芪有望成为提供黄芪多糖的成本较低的原材料。
       　　参考文献：
       ［1］  张小梅.黄芪多糖的免疫调节作用及抗肿瘤作用研究进展［J］.大连大学学报，2003，24（6）：101.
       ［2］  张善玉，朴惠顺，宋成岩.不同生长年限黄芪中总皂苷、黄芪甲苷、总黄酮及多糖含量比较［J］.延边大学医学学报，2005，28（2）：87.
       ［3］  杨勇杰,姜端芝,陈英红,等.猴头多糖HEP2化学成分研究［J］.天然产物研究与开发,2004，16（3）：194.
       ［4］  林忠宁,董胜璋,东书芸,等.MTT法检测T淋巴细胞增殖功能的方法学探讨与应用［J］.中国卫生检验杂志,2000，10(1):8.
       ［5］  陈阿琴，杨志刚，俞颂东，等.黄芪多糖药理作用研究进展［J］.中国兽药杂志，2005，35（9）：33.
       (延边大学长白山天然资源与功能分子省部共建教育部重点实验室，吉林 延吉  133000；延边大学药学院，吉林 延吉  133000)