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       【关键词】  柳叶；,,洗眼液；,,EV70病毒
       摘要：目的研究柳叶洗眼液并观察疗效，探讨柳叶洗眼液抗EV70病毒的作用。方法采用水提、醇沉、超滤、灭菌等方法从新鲜柳叶制备洗眼液；使用不同浓度的洗眼液对感染EV70的单层培养MEK细胞进行处理以观察其抗病毒效应。结果柳叶洗眼液对MEK细胞的最大无毒浓度为1/4药浓度。在病毒感染的同时给予柳叶洗眼液可明显抑制病毒的增殖。结论柳叶洗眼液具有明显的抗EV70的作用。
       关键词：柳叶；  洗眼液；  EV70病毒
       Preparation of Willow Leaves Eye Washing Liquid and Experimental Study of its Effect of Anti-EV70
       LIU Wei,LIU Jingdong,ZHUANG Jiaju, ZHANG Ruchun,MA Gang
       (Bethune Military Medical College,Shijiazhuang,050081,China)
       Abstract：ObjectiveTo make a kind of willow leaves eye washing liquid and observe its antivirus effect.MethodsEye washing liquid was made from fresh willow leaves by water extraction,extrafiltration and sterilization.Both infected by EV70 and non-infected single layer of MEK cells were treated by the eye washing liquid at diffferent concentration .ResultsIts highest harmless concentration used to treat the MEK cells was 25 percent of the original liquid.The EV70 proliferation was obviously inhibited through MEK cell treatment of eye washing liquid simultaneously EV70 infection.ConclusionWillow leaves eye washing liquid is a kind of effective antivirus agent.
       Key words：Willow leaf;  Eye washing liquid;  Enterovirus70(EV70)
   
　　流行性出血性结膜炎（epidmic haemorrhagic conjunctivitis,EHC）是由肠病毒70型（enterovirus 70,EV70）感染所致的一种传染性极强的眼病，目前此病主要以抗病毒药物治疗，但效果不甚理想，根据民间验方研制了柳叶洗眼液。为了更进一步了解柳叶洗眼液的抗病毒作用，我们选择了对EV70敏感并能产生细胞病变的猴胚肾（MEK）传代细胞作为检测系统，观察该药物的体外抗病毒效果。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料UV265型紫外-可见分光光度计（日本岛津）；柳叶Salix babylonica.L.（秋天现采现用或采集后低温放置）；邻苯二酚（优级纯含量99.9%）；其它试剂均为分析纯。
       1.2  方法
       1.2.1  柳叶洗眼液的制备
       1.2.1.1  处方柳叶200 g，焦亚硫酸钠1 g，乙二胺四乙酸二钠0.3 g，总量1 000 ml。
       1.2.1.2  制备方法取柳叶200 g，用常水洗后，再用蒸馏水洗，置玻璃烧瓶中，加水500 ml，加热提取1 h，滤出液体，药渣再加水500 ml，提取1 h，滤出液体，合并两次滤液。浓缩至500 ml，加95%乙醇1 000 ml，搅动匀，静置24 h，过滤，减压回收乙醇，至无醇味，加蒸馏水950 ml，焦亚硫酸钠1 g，乙二胺四乙酸二钠0.3 g，搅匀，用0.1 mol・L-1盐酸调pH 6~7，用0.3 μm滤膜抽滤，最后定容至1 000 ml，灌封于100 ml玻璃瓶中，100℃流通蒸汽灭菌30 min。
       1.2.2  质量标准
       1.2.2.1  性状本品为淡黄色透明液体。
       1.2.2.2  鉴别取柳叶洗眼液50 ml，置分液漏斗，加入乙醚50 ml，萃取3次，弃去水层，合并醚层，水浴回收乙醚，残渣用乙醇定容至5 ml。另取邻苯二酚制成每2 g・L-1甲醇溶液，作为对照品。照薄层色谱法试验［1］，吸取教训上述两种溶液各2～10 μl。分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-25%氨水（99∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，于碘蒸气中放置1 min，在与对照品相应的位置上，供试品色谱分别显相同的红棕色斑点。
       1.2.2.3  含量测定标准曲线的绘制：精密吸取邻苯二酚标准溶液（精密称取干燥至恒重的邻苯二酚10 mg,加95%乙醇5 ml溶解，加1mol・L-1盐酸5 ml，用水定容至5 ml）0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml量瓶中，分别加入1 mol・L-1盐酸2.4 ml，显色剂1 ml（亚硝酸钠10 g，钼酸钠15 g，加水溶解，定容至100 ml），1 mol・L-1氢氧化钠5 ml，用水定容至刻度，放置30 min，以水为空白，在波长（500±1）nm处测定吸收度。结果表明，邻苯二酚在1.5～9.0 μg・ml-1范围呈良好的线性关系，其回归方程为：A=0.081 7C+0.038 1，Y=0.999 6。含量测定：精密吸取柳叶洗眼液50 ml，置分液漏斗，加入乙醚50 ml，萃取3次，弃去水层，合并醚层，水浴回收乙醚，残渣用水定容至5 ml。精取1 ml，按标准曲线绘制方法测定吸度并计算含量。回收率实验：采用加样回收法，取已测含量的柳叶洗眼液适量，分别添加邻苯二酚，按柳叶的测定计算回收率，平均回收率为96.1%。RSD2.54%。
       1.2.3  抗肠道EV70病毒的实验
       1.2.3.1  细胞单层培养MEK传代细胞（由军事医学科学院五所微检中心细胞库提供），生长液1640含10%小牛血清，维持液1640含2%小牛血清，在37℃、5%CO2培养箱中，细胞培养24 h。
       1.2.3.2  病毒EV70毒株名：AHC/J670/71（购自昆明医学生物所）。实验用病毒均为我实验室用MEK细胞传代第2代。
       1.2.3.3  病毒感染及TCID50/ml滴定病毒感染及滴定在25×50 mm方瓶中、单层MEK细胞上进行，以细胞病变（cytopathic effect,CPE）作为病毒感染指标，每瓶细胞加不同稀释度病毒2 ml，每个稀释度接种4瓶细胞，室温吸附1.5 h后，弃去病毒液，加入维持液，33℃孵育，逐日观察CPE出现情况，滴度按Behrens-Kaerber方法计算，以TCID50/ml表示。
       1.2.3.4  柳叶提取液对MEK细胞的毒性实验采用柳叶提取原液、柳叶提取原液1/2浓度、柳叶提取原液1/4浓度3种浓度，分别加入到细胞中，在28℃不同时间，观察对细胞生长的影响。
       1.2.3.5  柳叶提液抗EV70作用为了确定柳叶提取液的抗病毒作用，采用病毒感染细胞的前60 min给药，感染细胞90 min后给药，病毒与药物同时加入到细胞中等不同的途径给药进行观察，观察细胞出现CPE的情况。
       　　2  结果
       2.1  EV70（AHC/J670/71）TCID50滴定经实验计算，该毒株LgTID50/ml为7.76；图中A~D显示EV70在MEK单层细胞中繁殖生长，产生CPE情况。见图1。
       a正常细胞对照，b~d分别为毒株感染（10-5）24、48、72 h细胞出现CPE情况
       图1  EV70（AHC/J670/71）在MEK单层细胞中繁殖产生CPE情况（略）
       2.2  柳叶提取液对MEK细胞的毒性表1显示MEK细胞在3种不同浓度柳叶提取液作用下，不同时间的细胞生长情况。结果表明：原浓度在细胞中作用60 min内，细胞无明显损伤。当原药浓度在细胞中作用90 min，80%以上细胞的生长形态发生不可逆改变，细胞变圆、肿大、折光性增加、最后裂解。柳叶提取液对MEK细胞的最大无毒浓度为1/4原药浓度。见图2。
       a正常对照；  b、c药物作用30，60 min
       图2  柳叶药物原液对MEK细胞生长的影响（略）
       表1  不同浓度药物对MEK细胞生长的影响（略）
       ―为无损伤 +为无明显损伤 ++为不可逆改变的损伤
       2.3  柳叶提取液的抗EV70作用实验中我们采用了EV70感染细胞的同时给药，攻击病毒量为100TCID50，给药物组细胞出现细胞病变的时间比无药对照组后延48～24 h，结果表明，在感染的同时用药，显示了对EV70的明显抑制作用，与对照组比较，用药组出现CPE的时间后延（当接种病毒量为1000TCID50/ml时，CPE出现延时12～24 h），CPE程度明显减弱，细胞存活率提高，通过活细胞计数发现，当无药对照组100%细胞出现CPE时，药物组产生CPE的细胞不到30%。见图3。
       a、b为加药组；  c、d为无药对照； b、d为a、c的4倍放大照片
       图3  药物+EV7010-5在试管内作用于1 h后，加入到细胞吸附1.5 h后，换维持液33℃孵育52 h时的结果（略）
       2.4  柳叶病毒作用效果观察固定柳叶提取原液浓度，观察不同浓度病毒抑制作用，结果表明，病毒攻击量低于或等于1000TCID50时，在48 h时，滴定柳叶提液组的病毒滴度比无柳叶提取液对照组降低了1.5～1.0 个对数单位，同时观察到，病毒稀释度愈高，柳叶液的抑制效果愈强，其细胞CPE程度弱，时间后延48～24 h，活细胞百分离增大。
       　　3  讨论
       柳叶主要含有水杨苷、碘、邻苯二酚、鞣质［1，2］等物质，其生理活性为协同作用，通过实验建立柳叶中邻苯二酚定性、定量的方法，仅作为柳叶或制剂质量标准的一项指标。制止病毒吸附，干扰病毒侵害细胞，是寻找抗病毒药物的一种途径［4，5］。实验结果表明，柳叶提取液对EV70有明显抑制作用［3］，在阻实验条件下细胞无毒性。在本实验中，当病毒感染细胞的同时加药，表现出较好的抑制效果。当药物浓度不变时，随着病毒感染剂量的减少，药物的抑制作用愈强，细胞病变出现时间明显后延，活细胞百分离增大，这也证实了柳叶提取液直接抗病毒作用。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会，中国药典，Ⅱ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录VIB.
       ［2］  冉先德.中华药海，上卷［M］.哈尔滨：哈尔滨出版社，1993：56.
       ［3］  陈  娟，黄祥瑞.柳叶1号药物抗EV70作用的体外效果观察［J］.军事医学科学院院刊，1993，23（1）：22.
       ［4］  De Clercq E.Chemotherapwutic approaches to the treatment of the AIDS［J］.J Med Chem,1986,29:1561.
       ［5］  Ishituka H,Ninomiya Y,Suhara Y.Molecular basis of drug resistance to new antirhinovirovirus agents［J］.J Antmicro Chemother ,1986,29:1561.
       (白求恩军医学院，河北 石家庄  050081)