高效液相色谱法测定妇康阴道泡腾片中没食子酸和盐酸小檗碱的含量
作者：黄毅，康爱荣，闫明，徐芳，严欢，姜丽娟，仲婕，王新堂
《时珍国医国药》 2005年 第11期
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【关键词】 高效液相色谱法
摘要: 目的: 建立妇康阴道泡腾片中没食子酸和盐酸小檗碱的含量测定方法。 方法: 采用高效液相色谱法，色谱柱为岛津Shampack VP ODS柱，测定没食子酸的流动相为0.2%甲醇的乙腈溶液-含0.1%三乙胺的0.1%磷酸水溶液（3∶97），检测波长为270nm;测定盐酸小檗碱的流动相为乙腈-含0.1%三乙胺的0.05mol・L-1 磷酸二氢钾水溶液（25∶75），混合后用磷酸调pH=3，检测波长为345nm。 结果: 没食子酸在0.02604～0.20832μg范围内呈良好的线性关系，r=0.9996，平均回收率为97.89%，RSD=1.27%（n=6）。盐酸小檗碱在0.01956～0.1956μg范围内呈良好的线性关系，r=0.9998，平均回收率为98.98%，RSD=1.39%（n=6）。 结论: 该法简单、快速、专属性强、重现性好，能够较好地控制产品的质量。
关键词: 高效液相色谱法; 没食子酸; 盐酸小檗碱; 妇康阴道泡腾片
Determination of gallic acid and berberine hydrochloridein Huichun vaginal effervescent tablets by HPLC
HUANG Y i KANG A i-rong， YAN M in， XU F ang， YAN H uan， JIANG L i-juan， ZHONG J ie， WANG X in-tan
（Xinjiang Institute of Materia Medica，urumqi830002China）
Abstract: Objective:To establish the methods for the determination of gallic acid and berberine hydrochloride in Huichun vaginal effervescent tablets.Methods:The separation was performed on Shimadzu Sham-pack VPS（150×4.6，5μm）column.The mobile phase of gallic acid was acetonitrile（with0.2%methonal）-0.1%phasphoric acid（with0.1%triehylamine）（3∶97）.The mobile phase of berberine hydrochloride was acetonitrile-0.05mol・L-1 potassium dihydrogen phosphate（with0.1%triehylamine）（25∶75，mixture and adjust pH to3.0with phasphoric acid）.The column temperature of gallic acid was35℃was25℃of berberine hydrochloride.The detection wavelength of gallic acid was at270nm，and was at345nm of berberine hydrochloride.Results:The linear of gallinic acid was in the range of0.02604～0.20832μg，r=0.9996.The average recovery was97.89%and RSD was1.27%（n=6）.The linear of berberine hydrochloride was in the range of0.01956～0.1956μg，r=0.9998.The average recovery was98.98%and RSD was1.39%（n=6）.Conclusion:The mothed is convient，rapid，relible and accurate.It can be used for quality control of Huichun vaginal effervescent tablets.
Key words: Huichun vaginal effervescent tablets; Gallic acid; Berberine hydrochloride
妇康阴道泡腾片是由没食子、黄连、菝葜、石榴皮等药材经粉 碎后制成的泡腾片，对多种类型的阴道炎均有效。处方中黄连的主要成分为盐酸小檗碱，有多味药材中含有没食子酸。为更好地控制其质量，本研究采用HPLC法测定了本品中没食子酸和盐酸小檗碱的含量，为本品的定量分析提供了新的方法。
1 仪器与试药
Shimadzu LC-10ATVP高效液相色谱仪，Shimadzu SPD-6AV检测器，Shampack VP ODS色谱柱。乙腈为色谱纯，甲醇、三乙胺、磷酸和磷酸二氢钾均为分析纯。没食子酸对照品和盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所），妇康阴道泡腾片自制。
2 实验方法
2.1 没食子酸的含量测定
2.1.1 色谱条件 岛津Shampack VP ODS柱（150×4.6，5μm）。流动相:0.2%甲醇的乙腈溶液-含0.1%三乙胺的0.1%磷酸的水溶液（3∶97），流速1.0ml・min-1 ，检测波长270nm，柱温35℃。
2.1.2 对照品溶液的制备及线性关系的考察
精密称取减压干燥至恒重的没食子酸对照品加50%甲醇制成每1ml含0.02604mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液1，2，4，6，8μl，按2.1.1色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品的量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程:A=476696C+678.56，r=0.9996，线性范围为0.02604～0.2083μg。
2.1.3 色谱行为与系统适应性实验
分别按照2.1.8.2及2.1.2项下方法制备供试品、阴性空白样品及对照品溶液，按照2.1.1项下的色谱条件，各进样10μl，如图1～3所示，阴性空白溶液色谱没有干扰。理论塔板数按没食子酸峰计算不低于1900，分离度为1.9。
2.1.4 供试液稳定性实验
按2.1.8.2项下制备供试品溶液，取供试品溶液分别在4，8，12，24h进样10μl，记录峰面积积分值，结果RSD为0.87%。可见供试品溶液在24h内稳定。
2.1.5 精密度实验
精密吸取同一供试品溶液，连续重复进样5次，记录峰面积积分值，结果RSD为0.76%。
2.1.6 重现性实验
取同一批样品，按2.1.8.2项下制备5份供试品溶液，分别测定没食子酸的含量，结果平均含量为0.7012mg・g-1 ，RSD为0.53%。
2.1.7 加样回收率实验 取同一批样品6份各约0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，分别精密加入浓度为0.1302mg・ml-1 没食子酸对照品溶液1，1.5，2ml，按2.1.8.2供试品溶液制备项下，自“用适量50%甲醇……”操作，各进样10μl，记录色谱图，计算回收率，结果见表1。 表1 妇康阴道泡腾片中没食子酸加样回收率实验结果 取样量/g样品中没食子（略）
2.1.8 供试品溶液的制备
2.1.8.1 提取溶剂和提取方法的确定
取本品20片，研细，取1g，精密称定，置100ml量瓶中，分别用下列方法处理。
a.用甲醇溶解并稀释至刻度，超声。分别于5，10，20，30min取样约2ml，高速离心，取上清液10μl注入高效液相色谱仪中，经测定峰面积分别为:33318，34109，33661，33855。
用50%甲醇溶解并稀释至刻度，超声。分别于5，10，20，30min取样约2ml，高速离心，取上清液10μl注入高效液相色谱仪中，经测定峰面积分别为:34717，34376，34645，34525。
实验结果表明，采用甲醇和50%甲醇做提取溶剂对没食子酸的含量影响不大，且当超声10min时，两者含量达到平衡。因此，综合考虑试验时间和经济确定供试品处理方法为:50%甲醇提取，超声10min。
2.1.8.2 供试品溶液的制备及测定
取本品20片，精密称定求得平均片重后，研细，取1g，精密称定，置100ml量瓶中，用适量50%甲醇，超声处理10min，放冷后，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。高速离心，即得（供试品溶液）。取三批产品按照上述方法制备。分别取10μl注入高效液相色谱仪中测定，结果见表3。
2.2 盐酸小檗碱的含量测定
2.2.1 色谱条件
岛津Shampack VP ODS柱（150×4.6，5μm）。流动相:乙腈-含0.1%三乙胺的0.05mol・L-1 磷酸二氢钾水溶液（25∶75），混合后用磷酸调pH=3，流速1.0ml・min-1 ，检测波长345nm，柱温25℃。
2.2.2 对照品溶液的制备及线性关系的考察
精密称取减压干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品加甲醇制成每1ml含0.01956mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液1，2，4，6，8，10μl，按2.2.1色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品的量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程:A=562287C-4.5178，r=0.9998，线性范围为0.01956～0.1956μg。
2.2.3 系统适应性实验
分别按2.2.8.2及2.2.2项下方法制备供试品、阴性空白样品及对照品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件，各进样5μl，如图4～6所示，阴性空白溶液色谱没有干扰。理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于2000，分离度为1.6。
2.2.4 供试液稳定性实验
按2.2.8.2项下制备供试品溶液，取供试品溶液分别在4，8，12，24h进样5μl，记录峰面积积分值，结果RSD为0.78%。可见供试品溶液在24h内稳定。
2.2.5 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液，连续重复进样5次，测定峰面积，结果RSD为1.08%。
2.2.6 重现性实验
取同一批样品，按2.2.8.2项下的方法制备5份供试品溶液，分别测定盐酸小檗碱的含量，结果平均含量为0.9672mg・g-1 ，RSD为1.24%。
2.2.7 加样回收率实验
取同一批样品6份各约0.125g，精密称定，置25ml量瓶中，分别精密加入浓度为19.56μg・ml-1 盐酸小檗碱对照品溶液7.5，12.5，15ml，按2.2.8.2项下，自“用盐酸-甲醇（1∶100）……”操作，各进样5μl，记录色谱图，计算回收率，结果见表2。表2 妇康阴道泡腾片中盐酸小檗碱加样回收率实验结果 取样量/g（略）
2.2.8 供试品溶液的制备
2.2.8.1 提取溶剂和提取方法的确定
取本品20片，研细，取0.5g，精密称定，共五份，分别置于50ml量瓶中，均用盐酸-甲醇（1∶100）溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。分别用超声提取法、水浴提取法、超声+热提取法处理。
a超声提取法:将样品进行超声处理，分别于10，20，30min取样约2ml，高速离心。分别取上述溶液各5μl注入高效液相色谱仪中，经测定峰面积分别为51317，51884，51692。
b热提取法:将三份样品置于60℃恒温水浴中，分别放置30，60，90min，取出后放冷，用盐酸-甲醇（1∶100）溶液分别稀释至刻度，摇匀，高速离心。分别取上述溶液各5μl注入高效液相色谱仪中，峰面积分别为53625，54068，54608。
c超声提取+热提取法:将样5置于60℃恒温水浴中15min，取出后再超声30min，用盐酸-甲醇（1∶100）溶液稀释至刻度，摇匀。放置过夜，高速离心。取上述溶液5μl注入高效液相色谱仪中，峰面积为54364。
实验结果表明，用超声提取法处理盐酸小檗碱的含量低于用热提取法和超声+热提取法处理;热提取法和超声+热提取法的提取时间虽相差较大，但测得盐酸小檗碱的含量基本平衡;用热提取法处理时水浴60min时盐酸小檗碱的含量达到平衡。因此，确定供试品处理方法为:盐酸-甲醇（1∶100）溶液提取，60℃恒温 水浴60min。
2.2.8.2 供试品溶液的制备及测定
取本品20片，精密称定求得平均片重后，研细，取内容物0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，用盐酸-甲醇（1∶100）溶液稀释至刻度，60℃恒温水浴60min后放冷，用盐酸-甲醇（1∶100）溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取样约2ml，高速离心，即得。取三批产品按照上述方法制备，各取5μl注入高效液相色谱仪中测定，结果见表3。表3 妇康阴道泡腾片中没食子酸和盐酸小檗碱的含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 将没食子酸对照品溶液进行UV吸收光谱扫描，其最大吸收波长为220nm和270nm。由于220nm波长靠近UV的末端吸收区，干扰较270nm处大，因而确定采用270nm作为本品的测定波长。没食子酸为可水解鞣质的结构单元，它的含量随提取条件不同差异较大，超声波提取法时间短，提取的主要为游离没食子酸。加热提取会使药材中所含的大量可水解鞣质水解，所以本实验没有采用加热提取的方法。
3.2 《中国药典》2000版Ⅰ部黄连药材中盐酸小檗碱含量测定，供试溶液的制备采用的是“2.2.8.1提取溶剂和提取方法的确定”中的c法，需放置1晚后再测定。研究中考察了超声提取法、热提取法及两者结合盐酸小檗碱的提取情况，试验结果表明，超声法和热提法均可。
3.3 据文献报道，测定没食子酸和盐酸小檗碱含量所用流动相有多种。本文曾以0.1%磷酸-甲醇（98∶2）、四氢呋喃-甲醇-0.2%磷酸（1∶1∶98）作为流动相测定没食子酸，分离效果均不理想，最终采用0.2%甲醇的乙腈溶液-含0.1%三乙胺的0.1%磷酸水溶液（3∶97）得到较好的分离;曾以乙腈-0.03mol・L-1 磷酸二氢钾、乙腈-0.05mol・L-1 磷酸二氢钾―三乙胺不同比例作为流动相测定盐酸小檗碱，但分离效果均不理想。经过反复摸索，发现用乙腈-含0.1%三乙胺的0.05mol・L-1 磷酸二氢钾水溶液（25∶75），以磷酸调pH=3作为流动相，峰形较好，且主峰与相邻峰达到基线分离。
参考文献:
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作者简介: 黄 毅（1970-），女（汉族），新疆乌鲁木齐人，现任新疆药物研究所助理研究员，硕士学位，主要从事药物制剂研究.
新疆药物研究所，新疆乌鲁木齐 830002
收稿日期: 2005-03-24