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       【关键词】  葛根素；,,糖尿病肾病模型；,,内皮素
       摘要：目的观察葛根素对糖尿病肾病内皮素表达的影响。方法利用链脲佐菌素腹腔注射法诱导建立1型糖尿病大鼠模型, 将实验用SD大鼠随机分正常对照组、糖尿病组、葛根素治疗组。治疗12周，观察治疗期间及治疗后大鼠的一般状况、血糖、尿素氮、血肌酐，内生肌酐清除率、24 h尿蛋白排泄率，免疫组织化学检测肾小球ET表达。结果造模组大鼠均出现肾脏功能损害；葛根素能改善基本状况，降低糖尿病大鼠的尿素氮、血肌酐、24 h尿白蛋白排泄率，增加内生肌酐清除率，ET表达显著降低。结论葛根素具有确切的肾脏保护作用。
       关键词：葛根素；  糖尿病肾病模型；  内皮素
       Effect of  Puerarin on the Expression of Endothelin in Streptozotocin-Induced Diabetic Nephropathy Rats
       ZHONG Jing，LIU Jianghua， WANG Caiyun, SHENG Jie, LIU Feng, WEN Long
       （Clinical Institute, The First Affiliated Hospital, Nanhua University, Henyang, Hunan, 421001,China;  Loudi Municipal Central Hospital of Hunan Province , Loudi, 417000,China;Department of Endocrinology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China）
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of puerarin on endothelin of streptozotocin-induced diabetic rats.MethodsDiabetic nephropathy rats were induced by intraperitoneal injection of STZ. Rats were divided into normal control group, model group, and Puerarin group for 12 weeks. During and after the treatment , the general state, blood glucose  levels, blood urea nitrogen, serum creatinine, urinary albumin excretion rate of the 24-hours， and clearance rate of creatinine， as well as endothelin were detected by immunohistochemical technology in different groups. Results① Diabetes mellitus and renal function lesion occurred in the two model groups. ② Puerarin could improve the general state, decrease  blood urea nitrogen, serum creatinine, and urinary albumin excretion rate of the 24-hours, increase clearance rate of creatinine,the expression of endothelin in the kidney was significantly inhibited at the same time.ConclusionPuerarin has certain protective effect on renal funtion.
       Key words：Puerarin;   Diabetic nephropathy models;  Endothelin
   
　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是严重的常见糖尿病慢性微血管并发症，是造成终末期肾功能衰竭的最常见原因。若在肾病早期阶段进行有效干预治疗，有希望延缓甚至逆转糖尿病肾病的发展。内皮素(Endothelin，ET)主要由内皮细胞产生，是目前已知作用最强和维持时间最持久的一种缩血管物质，是调节血管通透性的重要因子，是一种血管收缩和促有丝分裂肽，它在体内外均可影响肾脏结构和功能，已经有动物模型证实糖尿病与血浆和尿内皮素增高有关。此种增高很可能与糖尿病的特征性变化和肾损伤相关联，在糖尿病肾病早期病理变化的研究中是重要指征。多年研究证明，在糖尿病持续高糖状态下，体内氧化应激(oxidative stress)和非酶糖基化(糖基化)反应均很明显，在糖尿病肾病发病中起重要作用［1，2］，抑制氧化糖基化可能延缓或减轻糖尿病肾脏并发症，故我们拟以药物抑制糖基化和氧化应激两个方面为出发点，结合葛根素 （Puerarin）的作用机理，作者试用葛根素对模型糖尿病大鼠进行干预，以明确葛根素对糖尿病肾病发生、发展的影响，通过对糖尿病大鼠肾组织免疫组织化学的研究，观察葛根素对肾小球ET表达的影响，为扩大该药的临床应用范围提供实验依据。
       　1  材料与方法
       1.1  动物雄性SD大鼠50只，2月龄，体重200~250 g，清洁级；由湖南农业大学动物部提供。实验期间自由饮水，摄食饲料为中南大学动物中心提供的混合饲料，适应性喂养1周后进行实验。室温18~28℃，相对湿度62%~80%。
       1.2  仪器与试剂怡成 SENTEST手持式快速全血葡萄糖测试仪，日丽7170型自动生化，FJ-2008型免疫细胞记数仪（国营二六二厂生产），葛根素［Puerarin，棕黄色粉末(纯度90%),由湖南金农生物资源股份有限公司提供］; S-P免疫组化染色试剂盒、兔抗鼠血管内皮生长因子(anti-Fibronectin, anti-ET）抗体由武汉博士德生物公司提供。链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ, Sigma, Co. USA);将0.1mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）配成0.45%之溶液，使用前经微孔滤过除菌。免疫组化染色载玻片洗净，干燥分别放入以1：10比例去离子稀释的多聚氨酸及多聚氨酸（含有1/1 000 DEPC）的溶液中，浸泡5 min，60℃烤箱烘烤1 h干燥，装盒，备用。
       1.3  方法
       1.3.1  动物建模50只大鼠预养1周后，空腹12 h，腹腔注射1%STZ-柠檬酸钠缓冲液（STZ 60 mg/kg体重）。对照组注射等量柠檬酸钠缓冲液，依据72 h后尿糖+++~++++，静脉采血测血糖（怡成全血葡萄糖测试仪）血糖≥16.7 mmol/L者，确定模型建立，纳入本实验。除去造模失败及死亡大鼠，将30只糖尿病鼠纳入本实验。
       1.3.2  分组 糖尿病鼠随机分为①正常对照组（CN组 10只）；②糖尿病组（D组10只）；③葛根素治疗组（D+P组10只）。葛根素组每只腹腔注射葛根素80 mg/(kg・d)，均连续给药12周。各组为了避免酮症和维持糖尿病鼠的生存。②③组隔日腹腔注射长效胰岛素2~4单位，并断尾取血测大鼠血糖，使血糖波动在25 mmol/L左右，实验共12周。
       1.4  标本采集第16周实验终止时，各组大鼠在禁食的基础上，用代谢笼收集24 h尿，测定尿白蛋白(UAE)含量，动物经乙醚麻醉后称体重，股动脉放血5 ml测大鼠血糖、尿素氮、血肌酐，计算内生肌酐清除率。然后背部作纵形切口，取出肾脏，右肾称重，取左侧肾脏反复灌洗至发白，剔除包膜，横断切取约0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm柱状体2块，置于4%多聚甲醛（含1∶1 000焦碳酸二乙酯）中固定，固定12 h，石蜡包埋，连续切片，4 μm厚者用于HE染色，6 μm厚者切片用于免疫组化染色。
       1.5  观察指标
       1.5.1  动物一般情况观察每日观察大鼠饮食饮水量、精神状态、活动情况、大便性状及尿量、隔日测体重并加以记录。连续2 d记录每只大鼠的饮水量、尿量（用代谢笼收集尿液），取其平均值作为最终数据。
       1.5.2  肾脏湿重去包膜后用精密天平称重。
       1.5.3  生化指标用全自动生化仪测血糖、尿素氮、血肌酐。
       1.5.4  尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion ,UAE）收集24 h尿液，用二甲苯防腐，混匀后取2 ml用免疫细胞记数仪测定。
       1.5.5  肾小球滤过率（GFR）以内生肌酐清除率为代表，GFR＝（尿肌酐×尿量）/血肌酐。
       1.6  免疫组化检测操作步骤S-P免疫组化染色试剂盒采用生物系标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及低物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原，染色主要过程如下：①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH 7.4）冲洗3次，3 min/次。② 根据抗体的要求，对组织抗原用浓度为0.05%胰蛋白酶消化，消化时间为37℃,10~40 min，③ 每张切片加1滴50 u过氧化酶阻断溶液（试剂A），以阻断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10 min。④ PBS冲洗3次，3 min/次。⑤甩去PBS液，每张片加1滴或50 μl的非免疫性动物血清（试剂B），室温下孵育10 min。⑥甩去血清，每张切片加1滴或50 μl的第一抗体（用户自选），室温下孵育60 min或4℃过夜。⑦PBS冲洗3次，3 min/次。⑧甩去PBS液，每张切片加1滴或50 μl的生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10 min。⑨PBS冲洗3次，3 min/次。⑩甩去PBS液，每加1滴或50 μl链霉菌抗生物-过氧化酶容液（试剂D），室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，3 min/次。甩去PBS液，每张切片加滴或100 μl新鲜配制的DAB，显微镜下控制显色时间，阳性显色为棕色。自来水冲洗，苏木素复染。0.1%HCl分化,0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透明），中性树胶封固。阳性结果（主要在胞浆）显棕黄色，以PBS代替一抗作阴性对照。 免疫组化结果图像分析：采用计算机显微图像处理系统,在400放大倍数下每张片子随机选取10个视野区,对杂交信号结果进行灰度扫描,以其平均相对灰度值作为表达量的值(平均数±标准差表示)。
       1.7  免疫组化结果定性判别方法在显微镜下根据着色程度按以下标准判定结果：（1）阴性（－）：无黄色；（2）弱阳性（＋）：淡黄色；（3）阳性（＋＋）：黄色；（4）强阳性（＋＋＋）：深黄色或黄褐色。
       1.8  统计方法测定数值皆以 ±s表示，统计分析在SPSS10.0软件上进行。
       　　2  结果
       2.1  造模过程大鼠一般情况观察正常组大鼠体重增加明显，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。糖尿病大鼠精神逐渐萎靡、明显消瘦、多尿、多饮、早期多动，后期反应迟钝、动作迟慢、弓背蛇体、多汗出、毛竖无光泽、小便量多，需换垫料1~2次/d；有1只视力下降；有2只白内障；有1只出现反复腹泻。治疗各组精神状况良好，无白内障及尾、足坏死，动作自如，反应灵敏度较正常组稍差。
       2.2  药物对大鼠尿量、体重、肾重/体重、血糖的影响见表1。结果显示，造模成功的大鼠体重与正常组比较，明显下降，尿量增加，血糖升高，差异显著（P<0.05），治疗后， Puerarin药物治疗组与D组比较，体重、肾重/体重有显著提高（P<0.05）。
       表1  各组大鼠尿量、体重、肾重/体重、血糖的变化比较（略）
       与CN组比较，aP<0.05；与D组比较，bP<0.05；n=10
       2.3  药物对大鼠尿白蛋白排泄率、血肌酐、  肌酐清除率、尿素氮的影响见表2。结果显示，造模成功的大鼠血清尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮较正常组明显升高，内生肌酐清除率下降，差异显著（P<0.05），D组相比Puerarin治疗组，尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮明显升高，内生肌酐清除率下降（P<0.05）。
       表2  各组大鼠尿白蛋白排泄率、血肌酐、肌酐清除率、尿素氮的变化比较（略）
       与CN组相较，aP<0.05，与D组相较，bP<0.05；n=10
       2.4  药物对大鼠肾小球内皮素表达及血清糖化血红蛋白的影响HE染色镜下显示，光镜检查各组大鼠肾小球及小管间质未见明显的病理改变。模型组大鼠肾组织可见肾小球明显增大, 肾小球细胞增生，散在肾小管上皮细胞肿胀变性、脱落，肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚。各用药组中上述病理改变均有不同程度的减轻。免疫组化结果显示：与正常组相比，糖尿病状态下肾小球着色浓集，于肾小球系膜细胞、血管内皮细胞及少量肾小管上皮细胞胞浆均可见棕黄色颗粒颜色加深且数量增多，肾小球血管表面内皮素表达显著上调，呈强阳性，经灰度值测定两组间差异有非常显著性意义（P<0.05），治疗后， Puerarin治疗组肾组织着色较浅，与D组相比内皮素相对表达含量明显下调，呈弱阳性（P<0.05）。见表3及图1。
       表3  免疫组化各组大鼠肾小球ET表达的灰度值及血中糖化血红蛋白的比较（略）
       与CN组相较，aP<0.05，与D组相较，bP<0.05；n=10
       图1  肾小球内皮素免疫组化的图片（略）
       　　3  讨论
       糖尿病肾病的确切发病机制尚不清楚，但证实有多种血流动力学与非血流动力学因素参与。有研究认为［3］，由于糖脂肪代谢紊乱导致微血管病变，而肾内血流动力学改变直接参与DN的发生、发展。近年来，一些学者认为内皮功能失调，对大分子物质通透性增加和内皮细胞增生，可能涉及糖尿病微血管并发症和DN蛋白尿的发生机理［4］。内皮素来源于血管内皮细胞,是目前已知作用最强和维持时间最持久的一种缩血管物质，是调节血管通透性的重要因子,并与其他因子如血管表皮生长因子(VEGF)、NO等共同作用，NO是由NOS催化L-精氨酸与氧内皮素(ET)可能与此有关，是体内重要的缩血管物质。以往研究表明，糖尿病大鼠肾脏的ET信使核糖核酸(ET mRNA)含量增加［5］，肾脏ET的合成和分泌增多［5］，ET受体拮抗药可以使糖尿病大鼠的蛋白尿减少［7］。ET系统已被证实能通过促使血管收缩、促进细胞增殖及增加肾小球系膜细胞外基质合成等机制参与DN进展，其中ET活性最强。研究表明，ET强烈的缩血管效应，可以影响肾脏的血流动力学，使肾脏的血流量减少；ET可刺激血管紧张肽Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张肽转换酶(ACE)的产生，而AngⅡ又可增加肾内ET的含量,协同引起血管收缩、系膜增生、细胞外基质(ECM)堆积及基底膜增厚；更重要的是ET-1可以通过ET受体 A(ETAR)诱导TGFβ产生，血管内皮素(ET)增多是糖尿病肾病早期微量蛋白尿的原因之一，并与其他因素一起参与肾小球硬化。因此, ET可能成为防治糖尿病肾病的更为特异的新靶点对阻断ET合成或生物学作用具有重要意义。研究表明［8］，与DN发病密切相关因素如高血糖、氧化应激、AGEs和血管紧张素Ⅱ，TGFβ1均能诱导ET的产生和分泌。葛根素对糖尿病肾病有治疗作用［9］,但其确切机制未明。已有充分证据表明，体内高浓度葡萄糖与蛋白质发生非酶化促糖反应（糖基化）及由此形成AGEs在糖尿病肾病的发生中起重要的作用［10］。糖基化和氧化是两个密切相连的生化过程，两者相互促进，可能协同参与糖尿病肾病的发病过程。UAE是DN诊断的金标准［11］，ET和UAE的联合检测可能作为DN的监控指标，糖尿病肾病的临床诊断依据白蛋白尿的出现，而HbA1c水平在一定程度上反应体内AGEs的水平［12］。本研究证明，糖尿病组大鼠在注射STZ 16周后BUN，Ccr，尿蛋白及肥大指数均明显高于对照组,提示已有糖尿病肾病发生。近年来，更多的研究者在寻找维护内皮细胞功能正常，免受氧化糖基化和炎性因子损伤的药物，葛根是豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根,其主要有效成分即为Pue，化学名为4,7 二羟基 8βD葡萄糖异黄酮。Pue具有毒性小、半衰期短、可经多种途径排泄、不易在体内积蓄的特点。现代药理研究表明，其能降低血液黏度，抑制血小板凝集，降低血栓素A2 的水平，并能使明显增高的血浆内皮素、血管紧张素Ⅱ及肾素活性降低，从而扩张微动脉，改善肾小球的缺血、缺氧及高凝状态，可清除糖基化反应所产生的自由基，能够抑制酮亚胺经氧化产生的二羰基中间产物，并可减少氧化应激，达到有效抗氧化，进而抑制AGEs。已有报道［13］，葛根素可抑制体外非酶促糖化反应的棕色产物及荧光产物形成量。现有研究资料进一步表明［14］，葛根素和氨基胍（AG）抑制糖尿病大鼠体内AGEs形成的作用相近，是目前公认的作用最强的糖基化阻断剂，但由于AG的毒副作用目前临床还未被使用［15］。本研究证实经葛根素治疗的糖尿病大鼠ET免疫组化结果均较模型组明显为轻，提示葛根素能够抑制ET的作用，从而延缓DN发生发展的病理进程，葛根素可使大鼠一般情况改善，体重增加；ET表达减弱，尿量和肾重/体重比值减少；降低UAE，HbA1c，BUN，Scr，改善肾功能，达到有效抗氧化，进而抑制AGEs。总而言之，以药物抑制糖基化和氧化应激两个方面为出发点，可能为临床糖尿病肾病防治提供新的途径和思路。
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       基金项目：湖南省衡阳市科委资助课题(No.2005ks01-43)
       （南华大学附一医院临床医学研究所，湖南 衡阳  421001；湖南省娄底市中心医院  417000；中南大学湘雅医院，湖南 长沙  410008）