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       【关键词】  枇杷叶；,,指纹图谱；,,高效液相色谱法
       摘要：目的研究枇杷叶的高效液相色谱指纹图谱，为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法色谱条件：色谱柱为Kromasil C18（4.6×200 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(梯度洗脱)，检测波长为208 nm，柱温为25℃，流速为0.6 ml/min，使用“计算机辅助相似度评价软件”进行数据处理，对不同批药材指纹图谱的相似度进行比较分析。结果在本实验条件下测定10批枇杷叶药材，在色谱图中得到10个相应位置稳定的共有指纹峰。结论 该方法准确、重复性好，为枇杷叶的质量控制提供了理论依据。
       关键词：枇杷叶；  指纹图谱；  高效液相色谱法
       Study on the Fingerprint Chromatogram of Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl by HPLC
       ZHANG Changhao, WU Songji, ZHU Yanping, PIAO Huishan*
       (College of Pharmacy, Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China； Yanbian Institute for Drug Control, Yanji 133000, Jilin, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a sensitive and specific HPLC method for the quality control of Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl. MethodsThe chromatographic conditions of RPHPLC were: Kromasil C18（4.6 mm×200 mm, 5 μm）column, Methanol0.1% acetic acid(linear gradient elution), the detection wavelength at 208nm, temperature at 25℃ and flow rate being 0.6 ml/min, and data were analysed by “Computer Aided Similarity Evaluation”software to compare the quality of Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl samples of different batches. ResultsThe HPLC fingerprint of Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl, showing 10 characteristic peaks, was established from 10 batches of Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl and samples of different batches were of high similarity.ConclusionThis method is accurate, repeatable and provides a scientific basis for the quality control of Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.
       Key words：Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl；  Fingerprint；  HPLC
   
　　枇杷叶为蔷薇科常绿小乔木植物枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.的干燥叶，味苦，性微寒，具有润肺止咳、降逆止呕之功效，常用于治肺热咳嗽，吐血、胃热逆呕，烦热口渴等疾病。在我国分布广泛，大部分地区均有栽培，主产于广东、江苏、浙江、福建、湖北等地。近期对其化学成分的研究表明，其主要成分为三萜酸［1～4］和倍半萜及其苷类［4～6］，其药理活性的报道主要集中在三萜酸的抗炎［1］、降血糖［3］和抗病毒［4］活性方面。本实验选用不同产地及不同药材公司的10种枇杷叶药材进行了初步的HPLC指纹图谱方法学研究，并对不同产地和不同批次的药材指纹图谱进行了分析比较，以期建立枇杷叶药材的指纹图谱，建立起评价枇杷叶药材质量的方法。
       　　1  仪器与试药
       1.1   仪器岛津LC2010AHT高效液相色谱仪，双波长紫外/可见光检测器，LC solusen色谱工作站（日本岛津公司）。
       1.2  试剂 甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析醇。
       1.3  对照品、药材对照品：熊果酸（742200111）（中国药品生物制品检定所）；药材：各药材样品来源见表1，经吉林省药品检验所鉴定为蔷薇科常绿小乔木植物枇杷 Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.的干燥叶。
       表1  枇杷叶药材来源（略）
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱分析条件 色谱柱Kromasil C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%冰醋酸（B）水溶液梯度洗脱见表2；检测波长：208 nm；柱温：25℃；流速：0.6 ml/min；进样量：20 μl；记录时间：60 min；滞留时间：1.2 min。
       2.2   溶液的制备
       2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取熊果酸对照品，加甲醇制成每毫升含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。
       表2   流动相梯度条件（略）
       2.2.2  供试品溶液的制备  取本品粉末1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，分析前用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。
       2.3  测定方法  分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1。
       2.4   方法学考察
       2.4.1  稳定性实验取同一供试品溶液（编号2），36 h内进样6次，记录各共有色谱峰保留时间，供试品溶液通过HPLC分析，36 h内共有峰的相对保留时间相当一致，RSD＜3%，结果表明常温下供试品溶液在36 h内保持稳定。
       2.4.2  精密度实验同一供试品溶液（编号2），连续进样6次，共有峰的相对保留时间一致，RSD＜3%，表明进样的精密度良好。
       2.4.3  重现性实验取编号为2的样品6份，按上述方法制备供试品溶液并进行检测，考察各色谱峰相对保留时间比值的一致性，结果所考察的共有峰的相对保留时间具有较好的重现性，其RSD＜3%。
       2.5   枇杷叶HPLC指纹图谱及技术参数
       2.5.1  指纹图谱特征峰的标定根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关系数，枇杷叶原药材的化学成分的色谱峰在60 min之内全部出现，10 min以前有若干密集的峰难以有效分离，且这一部分特征在各批样品中差异很大，故在色谱峰的处理上，对10 min以前的区域，不进行积分，计算。考察10批样品的色谱图，找出其相对稳定的共有峰，以熊果酸为参照峰（10号峰），其它峰以阿拉伯数字按顺序标定，共标定10个共有指纹峰。见图1［A］。相对保留时间（特征峰号）：0.35（1），0.41（2），0.42（3），0.45（4），0.52（5），0.53（6），0.67（7），0.69（8），0.96（9），1.00（S，10）。相对峰面积均值（特征峰号）：2.19（1），0.52（2），0.25（3），0.19（4），0.18（5），0.25（6），0.35（7），0.56（8），0.27（9），1.00（S，10）。不同产地枇杷叶药材指纹图谱极为相似。由于指纹峰相对峰面积相差较大，故以10批特征指纹峰相对峰面积的均值列出。
       a枇杷叶药材    b熊果酸对照品
       图1   枇杷叶HPLC指纹图谱（略）
       2.5.2   特征指纹峰相对保留时间及相对峰面积进行10批样品分析，以10号峰作为参照峰，各指纹峰的峰面积及相对峰面积、保留时间及相对保留时间均具有较好的重现性。特征峰的相对保留时间基本符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》中关于药材部分的要求，RSD值均低于3.0%，见表3。但指纹峰的峰面积及相对峰面积相差较大（RSD大于3.0%），可能是产地的不同，其所含成分及各成分的量随气候、季节、采集时间、处理保存方法等诸多因素的影响而变化。
       2.5.3  指纹图谱相似度评价 采用国家药典委员会推荐的计算机辅助相似度评价系统软件，对10批样品进行数据处理，分别得到了用均数（相关系数）和中位数（相合系数）计算的指纹图谱与其共有模式的相似度值分别为：0.950，0.979，0.991，0.989，0.988，1.00（参照图谱），0.991，0.989，0.982，0.974（相关系数）；0.971，0.981，0.996，0.992，0.986，0.996，0.991，0.996，0.982，0.986（相合系数）。结果可以看出，10批样品具有较好的相似度，相关系数＞0.9。见图2。
       表3   指纹图谱主要共有峰相对保留时间（略）
       图2  10批枇杷叶药材的指纹图谱（略）
       　　3  讨论
       3.1   参照峰的选择在指纹图谱中一般选择含量较高且稳定的峰作为参照峰，熊果酸是枇杷叶中主要有效成分之一，含量较高且相对稳定，在测试过程中稳定出现，因此选择熊果酸峰作为参照峰。
       3.2   色谱条件的选择
       3.2.1  色谱柱的选择选择Agilent Hypersil ODS，FuJi Dimortions C18，Kromasil C18 三种不同的色谱柱进行测定，结果Kromasil C18峰分离效果最好，并且基线也最平稳，故采用依利特Kromasil C18色谱柱。
       3.2.2  流动相的选择选择三种流动相（A乙腈-B0.1%甲酸水溶液，A0.1%冰醋酸的乙腈溶液-B 0.1%冰醋酸水溶液，A甲醇-B0.1%冰醋酸水溶液），采用不同梯度洗脱，结果以流动相A甲醇-B0.1%冰醋酸水溶液的条件下峰分离效果最好，基线最稳定，漂移最小，故选择A甲醇-B0.1%冰醋酸水溶液作为流动相。
       3.2.3  检测波长考察取熊果酸对照品溶液（甲醇）在190～300 nm波长之间进行光谱扫描，其最大吸收波长为205 nm，测定中比较了205，208，210 nm，认为在208 nm 条件下测定的基线比较稳定，故选定检测波长为208 nm。
       3.2.4  检测时间的考察在此梯度条件下考察了60，80 min和120 min图谱，结果表明，所有的指纹峰在60 min内出现，故确定时间为60 min。
       3.2.5  柱温的选择根据对柱温在20，25 ，30℃ 的色谱图进行比较，发现没有明显差异，但考虑到本实验室温度，故选25℃。
       3.2.6  柱流速选择结合文献［7］考察了流速0.6，0.8 μl/min和1.0 μl/min，发现流速0.6 μl/min为好。
       3.3  色谱指纹图谱鉴别从本实验收集的10个样品来看，尽管各样品含量差异较大，但共有峰的保留时间一致。这就提示本实验在枇杷叶药材中，考虑到产地的不同，其所含成分及各成分的量随气候、季节、采集时间、处理保存方法等诸多因素可能影响成分含量的大小，但通过相对保留时间的对比，就可以做到准确鉴别。本课题初步研究了枇杷叶的指纹图谱，要满足对枇杷叶的全面质量管理，需要建立能够反映枇杷叶内在质量的、全面的色谱指纹谱，尚需进行大量样本分析和药效比较研究。
       　　参考文献：
       ［1］  Shimizu Mineo,fukumura Hideki,Hidekl Tsuji, et al．Anti-inflammatory Constituents of Topocally Applied Crude Drugs．I．Constituens and Anti-inflammatoryEffect of Eriobotrya Japonica LINDL［J］.Chem. Pharm. Bull，1986，34(6)：2614.
       ［2］  Liang ZhouZhong, Aquino Rita, De Feo Vincenzo, et al．Polyhydroxylated triterpenes from Eriobotrya Japonica［J］.Planta Med，1990，56(3)：330.
       ［3］  De Tommasi Nunziatina, De Simone Francesco, Cirino Giusepe, et al．Hypoglycemic effects of sesquiterpene glycosides and polyhydroxylated triterpenoids of Eriobotrya Japo-nica［J］.Planta Med，1991,57(5)：414.
       ［4］  De Tommasi Nunziatina, De Simone Francesco, Pizza Cosimo, et al．A study of their antiviral properties［J］.J Nat．Prod，1992，55(8)：1067.
       ［5］  De Tommasi Nunziatina, De Simone Francesc, Aquino Rita, et al．New sesquiterpene glycosides from Eriobotrya japonica［J］. J Nat．Prod，1990，53(4)：810.
       ［6］  De Tommasi Nunziatina, Aquino Rita, De Simone Francesc，et al．plant metabolites. New sesquiterpene and ionone glycosides from Eriobotrya japonica［J］.J Nat．pord，1992，55(8)：1025.
       ［7］  唐丽琴,刘圣,陈礼明,等.高效液相色谱法测定枇杷叶提取物中齐墩果酸与熊果酸的含量［J］.中国医院药学杂志，2004，24(12)：725.
       基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）资金资助项目（No.2004AA2Z373010）
       (延边大学药学院，吉林 延吉  133000; 延边州药品检验所，吉林 延吉  133000)