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       【关键词】  清金方；,,配方颗粒；,,指纹图谱；,,高效液相色谱
       摘要：目的研究清金方传统合煎液与其经过分煎制成的免煎配方颗粒混合物的化学成分的差异。方法采用HPLC色谱指纹图谱法，比较清金方免煎配方颗粒和清金方汤剂两者指纹图谱的差别，并通过相似度软件分析两者的相似性。结果清金方配方颗粒中共检出15个色谱峰，清金方合煎液和混合免煎配方颗粒指纹图谱的相关系数为0.873。结论 清金方合煎液同其分煎制成的免煎配方颗粒中的主要化学成分组成基本相同，其共有成分比例相近。
       关键词：清金方；  配方颗粒；  指纹图谱；  高效液相色谱
       Comparative Study on Fingerprints of Traditional Herbal Decoction and Compatible Granules of Qingjinfang by HPLC
       ZHU Lingying，KONG Ming， QIAN Dawei，SHEN Hong
       (Jiangsu Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the difference in main chemical composition between traditional herbal decoction and compatible granules of Qingjinfang. MethodsComparative study on fingerprints of traditional herbs decoction and compatible granules of Qingjinfang was conducted by HPLC, and Computer Aided Similarity Evaluation was applied to analyze similarity. ResultsThere were 15 peaks in the fingerprints of compatible granules of Qingjinfang and the correlation of both HPLC fingerprints was 0.873.ConclusionThe main chemical substances and the composition ratio of traditional herbs decoction and compatible granules of Qingjinfang are similar.
       Key words：Qingjinfang;  Granules;  fingerprint;  HPLC
   
　　中药配方颗粒是以单味中药饮片为原料，经现代工艺提取、真空浓缩、喷雾干燥、制粒等工序精制而成的一种粉末或颗粒状制剂，供中医临床配方时使用［1］。它既保持了汤剂吸收快、显效迅速的特点，又克服了汤剂服用前临时煎煮，久置易霉败变质的特点，还可掩盖某些中药的苦味。中药配方颗粒虽然在化学物质方面与饮片基本一致，但这并不能说复方汤剂合煎液与配方颗粒剂混合后用沸水溶解所得到的“合并液”成分相同。目前，针对中药配方颗粒单煎与合煎的争论尚未休止，但随着时间的推移，两种观点开始也有所共识。首先，合煎并非中药制剂的唯一工艺，几百种中药也不可能只存在唯一的提取方法；其次，合煎过程较为复杂，某种化学成分在其间可能出现或消失，甚至产生新的化学成分。分煎工艺与合煎工艺的合理性显然要结合处方具体分析，针对临床疗效的影响进行优胜劣汰［2］。因此这种成分上的变化是研究配方颗粒和传统合煎剂的前提工作。清金方为江苏省中西医结合医院临床常用的经验方，是由板蓝根、贯众、野菊花、鱼腥草、葶苈子、苏子、野老鹳草、矮地茶、百部、款冬花、黄芪、灵芝、牡荆油13味药组成。功能为清肺化痰，止咳平喘，主要用于急慢性支气管炎痰热证。通过本实验对传统合煎液和医院配药系统中常用的免煎配方颗粒的比较，期望总结出该方“分煎”与“合煎”的化学成分的变化［3～7］。
       　　1  仪器与试药
       1.1  仪器Waters高效液相色谱仪（Alliance 2695四元泵及自动进样系统，996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站）；KQ250E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Millipore纯水器。
       1.2  试药甲醇为色谱醇，水为超纯水，配方颗粒及药材由江阴天江药业有限公司提供。
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱条件 色谱柱：Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：起始甲醇0.4%冰醋酸（5∶95），30 min时，线性变化到甲醇0.4%冰醋酸（30∶70），90 min时，线性再变化至甲醇0.4%冰醋酸（60∶40），93 min时，线性再变化到甲醇-0.4%冰醋酸（95∶5），梯度结束平衡后20  min进入下一个样品分析；流速为1.0 ml/min；柱温35℃；进样量20 μl。
       2.2  供试品溶液的制备
       2.2.1  清金方合煎剂按清金方配伍量，精密称取饮片，加入10倍量蒸馏水煎煮2次，过滤，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇适量，超声提取30 min，过滤，滤液浓缩并定容至10 ml，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
       2.2.2  清金方混合配方颗粒按清金方配伍量，精密称取各配方颗粒，混合均匀，加甲醇10 ml，超声提取30 min，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
       2.2.3  药材取饮片适量，精密称定，加甲醇10 ml，超声提取30 min，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
       2.2.4  单味配方颗粒取配方颗粒适量，精密称定，加甲醇10 ml，超声提取30 min，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
       2.3  最佳检测波长的选择利用二极管阵列检测器的特点，对210～400 nm每隔10 nm分别观察指纹图谱，结果330 nm波长所得的图谱基线较稳，分离较好，紫外响应值合适，且反映的信息较多，故确定最佳波长为330 nm。
       2.4  精密度实验取清金方混合配方颗粒供试品溶液，连续进样5次，对主要的15个色谱峰进行了考察，计算峰面积RSD和保留时间RSD。结果各峰的峰面积和保留时间的RSD均小于5%。
       2.5  结果
       2.5.1   指纹图谱中各峰的确认以330 nm为检测波长。从清金方的配方颗粒液、药材合煎液色谱图中共分辨出15个峰，经过相同波长条件下对单味配方颗粒、单味药材提取液的色谱图比较，发现由于1号峰为各药材中一些极性很大的成分，在反相色谱柱中不保留，因此在单味配方颗粒、单味药材提取液中均有1号峰的体现，故无法确认属于哪个单味药材，因此不将其列入相关性分析。其余色谱峰经过确认，板蓝根拥有2号峰；贯众拥有3～7，9号峰；野菊花拥有3～10，15号峰；鱼腥草拥有2-3、5-6、10-13号峰；矮地茶拥有4、14号峰；款冬花拥有3，5～9，13号峰。其中2号峰为板蓝根、鱼腥草共有的色谱峰；3，5～6号峰为贯众、野菊花、鱼腥草和款冬花共有的色谱峰；4号峰为野菊花和矮地茶共有的色谱峰；7，9号峰为贯众、野菊花和款冬花共有的色谱峰；8号峰为野菊花和款冬花共有的色谱峰；10号峰为野菊花和鱼腥草共有的色谱峰；13号峰为鱼腥草和款冬花共有的色谱峰；上述这些共有的色谱峰由于色谱分离的条件所限，无法区别具体归属与哪味药材。
       2.5.2  清金方合煎液和混合免煎配方颗粒指纹图谱的比较从清金方合煎液和混合免煎配方颗粒得的指纹图谱两图直观比较来看（见图1），两者有一定相似性，同时也存在着一定的差异。以清金方合煎液为基准，发现清金方混合免煎配方颗粒的色谱图中15号峰边上多了一个峰，而7号峰的峰面积的相对比例要明显低于合煎液，但8，9，13号峰的相对峰面积则相反，是配方颗粒高于合煎液。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版（中国药典委员会）对两者的相关性进行分析，分析结果为两者的相关性为0.873。
       图1   清金方合煎液和配方颗粒提取物的HPLC指纹图谱（略）
       　　3  讨论
       3.1   配方颗粒生产与实验用药材为同一批次药材，以排除由于药材不均一而引起色谱图的差异。
       3.2  从清金方合煎液和混合免煎配方颗粒指纹图谱两图比较结果来看，由于方中药味较多，使得相似或相同的成分较多，在该色谱条件下，一个色谱峰往往是多味中药的共同体现。方中7号峰共属于贯众、野菊花和款冬花，而7号峰的峰面积的相对比例要明显低于合煎液，说明该成分在共煎的过程中，由于其它成分的增溶作用，使得溶出增加。又8峰共属于野菊花和款冬花、9号峰也共属于贯众，野菊花和款冬花，13号峰共属于鱼腥草和款冬花，这3个峰的相对峰面积则相反，是配方颗粒高于合煎液，结果表明，清金方颗粒在合煎的过程中，由于成分间的抑制，使得贯众、鱼腥草等中某些成分的溶出减少。同时清金方混合免煎配方颗粒的色谱图中15号峰边上多的一个峰，被证明是野菊花的峰，更说明野菊花中有成分在共煎过程中减少了溶出或是产生了共沉淀。
       3.3  在实验中同时比较了方中板蓝根、贯众、野菊花、鱼腥草、葶苈子、苏子、野老鹳草、矮地茶、百部、款冬花、黄芪药材和配方颗粒的指纹图谱，并对各自的相关性进行了分析。结果各药材和配方颗粒的相关性分别为0.989，0.367，0.853，0.222，0.883，0.875，0.917，0.921，0.831，0.801。通过上述相关性的分析，结果板蓝根、野菊花、葶苈子、苏子、矮地茶、款冬花、百部各自的药材和配方颗粒的相关性较好，而贯众、鱼腥草的相关性较差，更进一步说明了清金方配方颗粒与合煎液间的差异主要来源于这两味药。
       3.4    清金方合煎液和配方颗粒虽然在化学成分上有少量的变化，但从整体来说两者的相似度还是较高的，通过本次实验，对分析中药方剂的应用原理具有积极的意义，但想要确定清金方免煎配方颗粒是否能完全替代合煎液的应用，还需结合药理药效和临床效果来判断。
       　　参考文献：
       ［1］  邓轶渊，高文远，陈海霞，等.中药复方合煎与分煎的差异性研究进展［J］.中草药，2005，36（12）：1909.
       ［2］  陈长洲，冯艳妮.中药配方颗粒研制回顾与产业化展望［J］.世界科学技术－中药现代化，2002，4（4）：69.
       ［3］  戴开金，罗奇志，罗佳波.配伍对葛根芩连汤中葛根HPCE指纹图谱的影响［J］.中国中药杂志，2004，29（8）：819.
       ［4］  胡  柳，栾连军，程翼羽.复方有效部位与组方药材指纹图谱色谱峰相关性研究［J］.中国药学杂志，2004，39（12）：895.
       ［5］  刘  韶，雷  鹏，李新中，等.黄连解毒汤饮片汤剂和颗粒汤剂的指纹图谱比较［J］.中国药师，2005，8（2）：117.
       ［6］  史万忠，徐德生，刘  力，等.补肾方分煎和合煎提取物德指纹图谱比较［J］.中成药，2004，26（1）：7.
       ［7］  吕  红，吴雅红，陈立明.板蓝根颗粒UV指纹图谱的识别［J］.中成药，2005，27（2）：125.
       基金项目：江苏省社会发展基金资助项目（No.BS2003055）
       (江苏省中医药研究院・江苏省现代中药制剂工程技术研究中心，江苏 南京  210028）