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       【关键词】  圣和散；,,,脑胶质瘤；,,分化
       摘要：目的观察圣和散对脑胶质瘤C6细胞株体外生长及诱导分化的作用。方法用圣和散处理脑胶质瘤C6细胞，采用甲基噻唑基四唑(MTT) 比色法检测圣和散对C6 细胞增殖的抑制作用, 以免疫组化SABC法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和c-myc表达。结果圣和散可显著抑制 C6 细胞体外增殖，并呈现时间、剂量依赖性。在终浓度为5 mg/ml和10 mg/ml时,对 C6 增殖的抑制率达 (49.62±1.13) %和 (69.38±1.42) %，明显优于对照组（P＜0.01）。免疫组化可见 SHP组较对照组 GFAP 表达明显增强，c-myc表达下降。结论圣和散对胶质瘤 C6 细胞系的增殖有明显的抑制作用，能通过诱导分化降低脑胶质瘤细胞恶性程度。
       关键词：圣和散；   脑胶质瘤；  分化
       Inducing Differentiation Effect of Shenghe Powder on C6 Brain Glioma Cells
       XIA Yuesheng, WANG Jianhua, WU Yongzhong, WANG Huan
       （Fifth Staff Hospital of PLA,Shanxi 043801，China; Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Xi"an, 710038, China; Shanxi TCM College, Taiyuan 030024, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Shenghe Powder(SHP) on the proliferation and inducing differentiation of brain glioma C6 cell line in vitro.MethodsBrain glioma C6 cell line was co-cultured with SHP.Methyl thiagoly tetragolium (MTT) was used to measure the level of the proliferation of C6 cultured with SHP.The expressions of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and c-myc of C6 cells were detected by immunohistochemical SABC method. ResultsThe proliferation of C6 was obviously inhibited by SHP in a concentration- and time-dependent manner. The inhibitory rate was (49.62±1.13) % and (69.38±1.42) % in SHP at 5mg/ml and 10 mg/ml,compared with the control group, there was a significant difference(P<0. 01) .The expression of GFAP was obviously enhanced and c-myc decreased significantly in C6 cells cultured with SHP.ConclusionSHP can inhibit the proliferation of C6 and decrease malignant degree by inducing differentiation of the C6 cells .
       Key words：Shenghe  Powder;   Glioma;   Differentiation
   
　　脑胶质瘤是常见的脑肿瘤之一，由于其位置的特殊性和肿瘤本身的高侵袭性，手术难以彻底切除，术后复发率高，即使联合放化疗, 预后仍很差［1,2］。圣和散是我院多年来用于治疗脑胶质瘤的方药，它能否抑制脑胶质瘤增殖，诱导其分化是本实验研究的目的。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料鼠源性胶质细胞瘤 C6细胞系（引自第四军医大学西京医院）; DMEM细胞培养基（美国Gibco公司）;甲基噻唑基四唑 (MTT)、碘化丙锭（PI）、GFAP单抗、免疫组化 SABC试剂盒（美国Sigma公司）；c-myc单抗（英国 Novo公司）;酶联免疫仪（华东电子管厂 DG5031 型）。
       1.2  方法
       1.2.1  细胞培养鼠源性胶质细胞瘤 C6细胞常规培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml庆大霉素的 DMEM培养液中，在37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内传代培养。2 d换液1次，0.25%胰酶消化，传代。
       1.2.2    药物处理将中药SHP（主要含党参、太子参、玄参、炒白术、薏苡仁、土鳖虫、白花蛇舌草、肉苁蓉、蟾蜍、甘草）经多酶乳化流程水提后［3］，喷雾得干燥粉末，取适量磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，上清用0.22 μm的滤过膜过滤，配制成浓度10 mg/ml的药液。
       1.2.3  细胞生长抑制测定取对数生长期 C6 细胞, 用0.25%胰蛋白酶消化,10%胎牛血清DMEM培养基配制成104个/ml 单细胞悬液, 取100 μl (含103个细胞) 加入96孔板中,培养4h,细胞贴壁, 分为实验组(加 SHP,终浓度分别为2.5,5,10 mg/ml) 和空白对照组(不加 SHP),培养于37℃,5%CO2培养箱中培养,72 h后,加入 MTT 10 μl/孔,继续培养4 h ,吸去培养液,加入 DMSO 100 μl , 将培养板振荡5 min ,20 min以内以570 nm为测试波长,630 nm为参考波长, 在全自动酶标仪上读取各孔吸光度 (A值),每组8孔。肿瘤细胞生长抑制率的计算：抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。
       1.2.4    免疫组化 SABC染色法检测GFAP和c-myc表达在规定培养时间取 SHP处理组和对照组的C6细胞爬片,洗涤后经纯丙酮室温固20～30 min ,蒸馏水洗;纯甲醇加H2O2至0. 5 % ,室温浸泡30 min。蒸馏水洗3 次；滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min 后甩去多余液体；分别滴加适当稀释的一抗(1∶100) GFAP (小鼠 IgG)和 c-myc单抗,37℃ 1 h ,0.1 mol/L PBS 洗2 min 3次; 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃ 20 min ,0.1 mol/L PBS 洗2 min 3次;滴加试剂SABC ,37℃20 min ,0. 1 mol/L PBS 洗5 min 4次;室温下 DAB 显色,蒸馏水洗涤, 在400倍光镜下观察,阳性反应细胞核呈棕色或棕黄色。PBS 代替一抗作空白对照。每张切片随机抽取视野，至少计算1 000个细胞，阳性细胞所占比率为 GFAP和 c-myc表达的百分数。
       1.2.5    统计学处理所得数据以±s表示, 数据分析采用单因素方差分析。数据由SPSS10.0 软件包处理, P <0.05为显著差异性。
       　　2   结果
       2.1   SHP对C6细胞增殖的抑制作用SHP对C6细胞增殖有显著的抑制作用,且存在时间、剂量与抑制率的量-效关系。结果见表1~2。
       表1  时间与抑制率的量-效关系（略）
       与24 h比较，*P＜0.05
       表2  剂量与抑制率的量-效关系（略）
       与 SHP2.5 mg/ml比较，▲P＜0.05
       2.2  SHP 对C6细胞 GFAP和 c-myc表达的影响在SHP 实验组和对照组C6细胞呈现不同程度的阳性反映, 阳性反应细胞核呈棕色或棕黄色。SHP实验组和对照组比较GFAP表达明显增加，c-myc表达减少,统计学有差异显著(P< 0.05)，且存在量-效关系。结果见表3。
       　　3  讨论
       脑胶质瘤亦称脑神经胶质细胞瘤，包括多种发生于神经外胚层的肿瘤，约占颅内肿瘤的30%~70%［4］。脑恶性胶质瘤的生物学特征是侵袭性生长,与周围正常脑组织无明显界限, 尤其是位于功能区肿瘤,手术难以彻底切除，单纯手术预后极差, 50%死于6个月内,5年生存率仅6%,联合放化疗仍难获得理想疗效 ［2，5］。究其原因除手术因素外，胶质瘤细胞对放化疗的拒抗，成为提高疗效的主要障碍［2］。
       表3  SHP对C6细胞GFAP 和 c-myc表达（略）
       与对照组比较，*P＜0.05，▲P＜0.01
       诱导分化治疗是治疗脑胶质瘤的新途径，它是针对肿瘤细胞的发育缺陷, 通过诱导使低分化的肿瘤细胞进一步分化成为接近正常的“成熟细胞”,致使大量细胞退出增殖周期转入静息状态,从而起到治疗的作用 ［6，7］。肿瘤细胞的增殖能力与其分化水平有着密切的关联，肿瘤细胞分化越差,增殖越快。研究表明, GFAP是判断胶质细胞分化程度的可靠指标，GFAP是主要存在于星形细胞中的一种中间丝机构蛋白。其表达与星形细胞的发育和分化有密切的关系。随着星形细胞的成熟,GFAP 的表达逐渐增强［8］。本实验中，5mg/ml与10mg/ml SHP均能明显上调GFAP 的表达，且存在量-效关系。c-myc基因是一种控制细胞增殖和分化的原癌基因,具有调节细胞增殖和凋亡的双重作用。c-myc高表达使细胞具有高度增生潜能，同时还抑制了细胞的分化。在脑胶质瘤中存在 c-myc mRNA异常过量表达，c-myc基因表达异常增加与胶质瘤的发生、发展密切相关,其表达水平也是评价胶质瘤生物学行为和患者预后的有价值的参考指标［9，10］。本实验显示，SHP能下调 c-myc蛋白表达，诱导C6分化，促使恶性向良性转化。提示 SHP抑制胶质瘤的生长,与调节 GFAP和 c-myc蛋白诱导肿瘤细胞分化有关。
       　　参考文献：
       ［1］  Laws ER，Parney IF, Huang W, et al. Survival following surgery and prognostic factors for recently diagnosed malignant glioma: date from the Glioma Outcomes Project［J］. J Neurosurg, 2003, 99(3):467..
       ［2］  Matsutani M. Chemoradiotherapy for brain tumors: current status and perspectives［J］. Int J Clin Oncol. 2004, 9(6):471.
       ［3］  夏跃胜.中药多酶乳化方法.中国专利: ZL02135678.5, 2004-11-10.
       ［4］  张纪.深入开展胶质瘤综合治疗及其基础研究［J］.中华神经外科杂志，2003,19(1):1.
       ［5］  张永禄,杨天恩. 肿瘤放射治疗学［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：737.
       ［6］   Linskey ME, Gilbert MR. Glial differentiation:a review with implications for new directions in neurooncology［J］.Neurosurgery, 1995,36 (1)：1.
       ［7］  Cuevas P, Diaz-Gonzalez D, Dujovny M. Differentiation-inducing activity of neomycin in cultured rat glioma cells［J］.Neurol Res. 2004,26(4):401.
       ［8］  Sadatomo T, Yoshida J , Wakabayashi T , et al . New approach for the treatment of med alloblastoma by transfection with glial fibrillary acidic protein gene［J］.Surg Oncol , 1996,5(2) :69.
       ［9］  Chang YC, Chou FP, Huang HP, et al . Inhibition of cell cycle progression by penta-acetyl geniposide in rat C6 glioma cells［J］.Toxicol Appl Pharmacol,2004,198(1):11.
       ［10］  Jensen NA, Pedersen KM, Lihme F, et al.Astroglial c-myc over expression predisposes mice to primary malignant gliomas［J］. J Biol Chem. 2003, 278(10):8300.
       基金项目：山西省科技发展计划项目（No.002059)
       (中国人民解放军总后勤部第五职工医院，山西 闻喜   043801；中国人民解放军第四军医大学唐都医院，陕西 西安  710038；山西中医学院，山西 太原  030024)