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       【关键词】  天花粉蛋白；,,HeLa细胞；,,细胞凋亡
       摘要：目的研究天花粉蛋白(TCS)对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用, 探讨TCS抗肿瘤的作用机制。方法采用MTT法检测TCS对Hela细胞的抑制作用，形态学观察、DNA电泳及流式细胞仪检测TCS对HeLa细胞的诱导凋亡作用。结果TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用，显微镜下可见细胞圆缩，胞浆凝聚等凋亡细胞的形态学改变，DNA凝胶电泳呈梯级格局，流式检测出现凋亡峰，凋亡比例具有剂量和时间依赖性。结论 天花粉蛋白通过诱导细胞发生凋亡而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。
       关键词：天花粉蛋白；  HeLa细胞；  细胞凋亡
       Experimental Study of Trichosanthin"s Effect on Hela Cells Proliferation
       HUANG Yiling,  HUANG Liming*,  HUI Yan, LU Hua
       (Morphology Department of Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effect of trichosanthin(Tcs) on  Hela cells and its anti-tumor mechanism.MethodsThe antiproliferative effect of TCS on Hela cells was measured with MTT assay. Light microscopy was used to observe the morphology changes , DNA agarose electrophoresis and FCM analysis were carried out to examine the induced apoptosis.ResultsThe proliferation of HeLa cells was significantly inhibited by TCS, Hela cells showed a serial of characteristic changes of apoptosis such as cell  volume shrinkage , chromatin  condensation; the occurrence of DNA ladder  and apoptosis  rate of  Hela cells was dose and time dependent. Conclusion Trichosanthin can inhibit the proliferation of Hela cells by its induction of apoptosis.
       Key words： Trichosanthin;  Hela cell;  Proliferation
   
　　宫颈癌是导致妇女死亡的第二大原因，严重威胁女性身体健康。天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是从葫芦科植物栝楼（Trichosanthin kirilouii Maxim）的块根中提取出来的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome - inactivating protein , RIP)，具有多种生物学效应，主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用［1］ 。目前，TCS的抗肿瘤研究主要集中在绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤和白血病等方面［2～3］。本实验研究TCS对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用，并从诱导细胞凋亡的角度探讨其抗癌作用，为药物的进一步研究开发提供实验依据。 
       　　1  材料与方法 
       1.1  试剂   MEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide ，PI）及RNase A (RNA酶)为Simga公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。二甲基亚砜(DMSO)购自Fluka公司，TCS购自上海金山制药厂（纯品，规格为1.2 mg/ml）。
       1.2  细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存,培养于5%CO2，37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10%FBS，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L链霉素，取对数生长期细胞待用。
       1.3  细胞生长抑制实验采用噻唑蓝(MTT)还原法进行检测:将Hela细胞接种于 96 孔细胞培养板内(每孔的细胞数为2×104个)，细胞贴壁后对照组换新鲜培养基，实验组换用含有不同浓度TCS的培养基，置 CO2 培养箱内分别培养 24 ，48，72 h ，去上清，加入 MTT 溶液200 μl/孔，置 CO2 培养箱内培养 4 h，去上清，每孔加入200 μl DMSO ，轻度振荡后，测定 570 nm 处光吸收值。取8孔吸收值平均数，按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%计算药物对细胞生长的抑制作用。
       1.4  细胞凋亡的检测
       1.4.1  细胞形态学观察  将处于指数生长期的Hela细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察Hela细胞的形态改变。
       1.4.2  DNA琼脂糖凝胶电泳　胰蛋白酶消化收获实验组及对照细胞, 1 000 r/min离心5 min,PBS清洗细胞两遍, NP40溶液作用细胞沉淀,加入SDS(终浓度1%)及RNase(终浓度2 μg/μl)，56℃处理2 h，蛋白酶K(终浓度2 μg/μl)37℃作用3～5 h， 加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍体积的无水乙醇，轻轻振摇后置于-70℃冰箱中过夜, 14 000 r/min离心15 min，弃上清，用冰冷的 70％乙醇漂洗，1.2% 琼脂糖凝胶30 V电泳3～5 h，紫外观察拍照。
       1.4.3   流式细胞仪检测分别离心收集对照组及实验组细胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定, 在10  000 r/min条件下离心5 min，去乙醇，PBS洗涤两次，弃上清；用0.5 ml PBS重悬，加入等体积的细胞裂解缓冲液室温作用5    min，加Rnase A (终浓度30 μg/ml)置37℃水浴中消化30 min，离心后再加人1m1 PI染色(终浓度50 μg/ml)避光染色30 min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测， Multicycles 软件分析结果。
       1.5  数据统计分析用 SPSS 10.0 for windows统计软件包作ANOV方差分析。
       2  结果
       2.1  MTT法测定结果20，40和80 μg/ml的天花粉蛋白分别作用于Hela细胞后，随着作用时间的延长，细胞的生长抑制率逐渐升高,且抑制率随药物浓度增加而上升, 呈一定的剂量、时效依赖性。结果见图1。
       图1  TCS对Hela细胞作用的时间-剂量曲线（略）
       2.2  Hela细胞的形态学改变  镜下可见(×200)对照组Hela细胞始终为多角形，梭形，贴壁牢固, TCS处理的Hela细胞逐渐变圆, 细胞体积缩小，胞浆凝缩, 折光率增强, 呈现凋亡细胞的形态改变。结果见图2。 
       图2  Hela  细胞形态改变（略）
       2.3   DNA凝胶电泳图谱  凝胶电泳分析经不同浓度的TCS（20，40和80 μg/ml）处理48 h的Hela细胞DNA断裂成相差约200 bp的片段，呈现凋亡细胞的梯级（ladder）格局，而对照组细胞DNA无断裂现象。结果见图3。
       图3  凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳（略）
       2.4  细胞凋亡的检测  凋亡细胞在流式细胞仪直方图上可出现特征性的亚二倍体峰（sub―G1 peak）。由表1可见, 随着天花粉蛋白药物浓度的增大及作用时间的延长，凋亡细胞的比例增加，表明TCS诱导Hela细胞凋亡具有时间和剂量依赖性。
       表1  凋亡细胞在各组标本中所占的百分比时间（略）
       　　3  讨论
       细胞凋亡是细胞生长、发育过程中发生的一种复杂的生理过程。Dunne等［4］发现肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱密切相关。有资料表明，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡而达到治疗的目的，有效的诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新的手段之一［5］。天花粉蛋白(TCS)是一种有效并具有专一性的抗肿瘤药物，与一般化疗药物造成的肿瘤细胞和正常细胞两败俱伤的作用不同，它对人的外周血淋巴细胞、T细胞和羊膜细胞等正常体细胞影响极小［6］，具有显著优势。天花粉蛋白是Ⅰ型单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein , RIP)，能进入细胞内直接使核糖体失活。TCS能够使绒毛癌细胞发生凋亡,其诱导凋亡的作用与胞内的Ca2+浓度升高和活性氧基团(reactiveoxygenspecies，ROS)的产生有关［7～8］。本实验将天花粉蛋白处理HeLa细胞后，HeLa细胞的生长受到明显抑制，出现凋亡的特征性改变：染色体凝聚、核碎裂等形态改变，凝胶电泳呈现典型的梯级（ladder）格局，流式结果可见特征性的亚二倍体峰，且凋亡细胞的比例随药物浓度的增高及作用时间的延长而增高。这些结果表明TCS对Hela细胞具有良好的抑制作用和明显的诱导凋亡效应，并具有浓度和时间依赖性，初步显示了良好的药物开发前景。对其抗癌机理进行深入研究，有望应用于宫颈癌等肿瘤的临床治疗。
       参考文献：
       ［1］  Shaw PC ,lee KM ,wong KB.recent advances in trichosanthin, a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties ［J］.Toxicon.2005, 45(6)：683.
       ［2］  汪  猷，金善炜.天花粉蛋白，第2版［M］.北京：科学出版社，2000.
       ［3］  孙  ，涂水平，吴裕圻，等.天花粉蛋白诱导胃癌细胞MKN245凋亡中P53、Bcl2、 cmyc蛋白表达变化［J］.上海医学，2001，21（4）：291.
       ［4］  Dunne AL,Price ME,Mothersill C,et al.Relationship between clonogenic radiosensitivity ,radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells［J］.Br J Cancer.2003,89(12)：2277.
       ［5］  Waxman DJ,Schwartz PS.Harnessing apoptosis for improved anticancer gene therapy［J］.Cancer Res,2003,63(24)：8563.
       ［6］  戴荣禧，徐国江，刘莲英，等. 天花粉蛋白对滋养层细胞专一损伤机制的研究［J］.实验生物学报，1993，26（24）：411.
       ［7］  Zhang CY,Gong YX,Ma H,et al.Reactive oxygen species involved in trichosanthin induced apoptosis of human choriocarcinoma cells［J］.Biochem,2001,355：653.
       ［8］  Zhang CY,Gong YX,Ma H,et al.Trichosanthin induced calcium dependent generation of reactive oxygen species in human choriocarcinomacells［J］.Analyst,2000,125(9)：1539.
       基金项目：湖北省教育厅重大科研项目(No.Z200513002)
       
　　　　　　　湖北省教育厅重大科研项目(No.2002Z53004）
       
　　　　　　　湖北省科技攻关项目（No.2005AA401C57）
       (三峡大学医学院， 湖北 宜昌  443002)