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       【关键词】  生物技术；,,中药；,,现代化
       摘要：目前，在我国中药产业呈持续发展趋势的同时，也存在着中药材质量不稳定、品种混乱、无严格的质量标准体系等诸多问题，所以应用现代生物技术完善其不足，势在必行。自20世纪80年代PCR技术问世至今，现代生物技术领域进入了一个新时代，并且在中药现代化研究中展示出良好的应用前景。例如，用分子标记技术进行中药材的甄别和品种选育；利用遗传转化、组织和细胞培养手段进行药用植物的保护等。该文对现代生物技术在中药现代化的应用进行了全面、深入的论述。
       关键词：生物技术；  中药；  现代化
       The Application of Modern Biotechnologies in the Modernization of Chinese Traditional Medicine
       GENG Panpan， YANG Dongzhi*， HUANG Xiangnan， LIU Haijuan， ZHANG Jing
 
　　（Bioengineering Department of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001,China）
       Abstract： Nowadays, the traditional Chinese medical industry of our country shows a tendency of developing continuously, but there are also a lot of problems，such as the unstable quality of Chinese medicinal materials, the disordered variety , absence of the strict quality standard system and so on.  So it"s essential to make use of the modern biotechnologies to improve its deficiency.  Since PCR technology came out in the eighties of the last century, the modern biotechnologies have entered new period and shown a well application prospect in the modernized research of traditional Chinese medicine. For example, use the molecular marker technology on discriminating Chinese medicinal materials and selective breeding, utilize genetic transformation, tissue and cell cultivation technologes to protect the medical plants, etc.  This text gives a comprehensive and in-depth review on the application of modern biotechnologies in traditional Chinese medicine.
       Key words：Biotechnology;  Traditional Chinese medicine;  Modernization
   
　　中药是祖国医学防病治病的物质基础，是我国传统药学宝库，包含中药材、药材饮片及中成药。中药在医疗保健中发挥着越来越大的作用，对进入高龄化社会的21世纪来说，中药制剂作用缓和、对慢性疾病疗效显著，适于老年患者,具有广阔的发展空间［1］。但在现代主流医学中，中医药仅扮演配角，竞争力明显低于国外同行业。据统计，日本一家中药企业用中国的“六神丸”配方和地道中药材制成“救心丹”后返销我国，2003年在我国的销售额达1亿美元。韩国仅“高丽参”一项出口就相当于我国全部中药材出口额的50%，价格比我国人参高出10倍左右。国际市场上中成药的销售额每年约160亿美元，日本占80%，韩国占10%，而我国只占5%左右。专家认为，“洋中药”疗效稳定，质量可控，特别是在有效成分提纯方面科研创新和技术水平高。而我国中药还未摆脱传统用药方式，即使是制成的丹、丸、散、片，也有着标准不一、质量不稳的问题。绝大多数中成药在安全性及有效性方面没有完整的科学数据，从原材料到产品生产缺少可控的质量标准，中药产品与国际药品标准和要求并不接轨。我国中药资源丰富，历史悠久，但这一优势在竞争激烈的国际医药市场上却没有得到充分体现，在出口及基础研究领域落后于日本、韩国、台湾等国家和地区。中药材原料生产与质量标准化，是我国中药现代化的最大“瓶颈”。要改变这种局面，争得世界传统药物市场的一席之地，针对控制标准不科学，生产管理不够规范，药物作用机理和毒理作用不明确以及新药有效成分的筛选缺乏科学性这些弊端，唯有利用现代生物技术改造中药，加快中药现代化进程。
       　　1  中药现代化
       中药现代化是以中医药基础理论为指导，用现代科学技术，研究中药的科属种源、成分分析、炮制研究、组方原理、制剂开发、制剂标准、质量控制等一系列工作。现代化中药产品的特点为三效：高效、速效、长效；三小：剂量小、毒性小、副作用小；三便：便于储藏、便于携带、便于服用［2］。
       　　2  中药现代化中的一些生物技术
       2.1  色谱技术提取分离中药有效成分难是导致中成药疗效差、质量不可控的主要原因，应用色谱技术可改善这一关键技术难题。色谱主要是利用物质在流动相与固定相中的分配系数差异而分离样品。样品中的各组分在两相相对运动时被多次分配，分配系数大的组分迁移速度慢；反之则速度快，因此被分离。20世纪70年代高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)崛起，弥补了气相色谱法(Gas Chromatography, GC)不能直接用于分析、难挥发、不稳定及高分子样品的弱点，扩大了色谱法的应用范围［3］。20世纪80年代末毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis, CE)快速发展，分离效果(柱效可达到107)远大于经典的色谱法。CE易于选择各种分离性的添加剂，能较好地弥补HPLC效率低、扩散系数小等不足［4］。Zauggs等［5］用β-环糊精为手性添加剂，以十二烷基硫酸钠为表面活性剂的方法分离奎宁、奎尼丁等化合物，鉴别出奎宁、奎尼丁。SFE-HPLC(超临界流体萃取-高效液相色谱)联用体系，用于自动化萃取芳香族化合物，选择性强、灵敏度高。Beike等［6］用LC-MS法定量测定了人血、胃内容物和组织中的紫杉碱和异紫杉碱。Setzer等［7］采用LC-NMR和LC-MS相结合的方法，对佛手柑类植物(Stauranthus perforatus)的树皮二氯甲烷提取物中有细胞毒作用的成分进行了分析，鉴定出6种呋喃香豆素类化合物和9种喹啉生物碱(其中7种为新化合物)。
       2.2  DNA遗传标记、电泳技术DNA作为生物群体细胞中的遗传物质，具有遗传稳定性，代表了该种群的基本遗传特征，对其标记，制定出其正品的标准DNA指纹图谱，为鉴别不同类别中药提供了方便快捷的方法。主要有扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP），限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) ，随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD) ，微卫星DNA，任意引物PCR等。RAPD简便、快速，应用最广，已鉴定了木蓝属8种生药、铁线莲属7种生药和西红花［8］等。用RFLP技术鉴定了羽扇豆属药用植物的亲缘关系与所含生物碱类成分的相关性。PCR直接测序技术用于鉴定人参、鸡内金、鹿鞭等。高效毛细管电泳法(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是近几十年飞速发展起来的新的分析技术，它根据离子在缓冲液中迁移的速度与电场呈正比原理,将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体，展示出特有的分离能力与极大的应用前景。如用于测定茶碱血浆浓度［9］,测定中药、中成药的有效成分含量［10］。
       2.3  分子免疫技术疾病发生时异常基因功能的实现最终还依赖于蛋白质表达,中医药预防和治疗疾病的疗效最终也往往落实到蛋白质,通过对有关蛋白质的调控而发挥作用［11~12］，因此,观察蛋白质水平的变化是中医药作用机制研究的重要环节。分子免疫技术检测的原理是应用已知特定的抗体(抗原)对标本中相应的抗原(抗体)蛋白进行定性或定量的检测。应用于中药材，鉴别其真伪，特异性强。目前主要包括免疫印迹法、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫酶技术、免疫-聚合酶链式反应技术等［13］。
       2.4  转基因技术国外获得成功的转基因药用植物有8种，其中转基因烟草可以生产人用溶酶体酶及多种人与动物疾病抗体，转基因玉米生产重组霍乱疫苗、单克隆抗体等。药用植物基因工程起步较晚，但也有一些可喜成果，方法主要有农杆菌介导的基因转移、种质系统的基因转移和外源基因直接导入法。以Arntzen研究小组为代表的多个研究组相继在烟草、马铃薯、苜蓿等植物中成功表达了乙肝病毒表面抗原、大肠杆菌毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒衣壳蛋白等［14］。戴均贵等［15］用长春花悬浮培养细胞实现了对天麻素的生物转化。转基因技术广泛地用于优化种质，保护和繁殖珍稀濒危动、植物品种，保证中药资源的可持续发展。提高表达效率，大规模生产仍是目前研究的难点。
       2.5  基因芯片技术基因芯片技术可显示出中药作用的所有靶基因。药物处理后基因表达的改变对研究药物作用机制有一定的提示作用。此技术可以分析单味中药或中药复方用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，从而发现一组病症相关基因和药物效应基因，作为药物筛选靶标，优化靶点，开发新药。同时可对中药中的各种成分进行平行筛选，比较各种成分作用后机体基因表达的差异，结合体内组织学和生物化学的改变，探索中药的有效成分及存在状况，寻找有效部位和制备单体。现在北京、上海的两个国家级药物筛选中心均已采用此技术对中药提取物和天然化学成分进行筛选，浙江江南生物科技有限公司已经研制出中药鉴定和筛选的基因芯片。王军等［16］用此探讨局灶硬化性肾小球肾炎模型小鼠的细胞因子表达谱，以及复方积雪草对其细胞因子网络的表达调控作用。余榕捷等［17］利用基因芯片研究六味地黄丸对老年大鼠基因表达的影响。吴伟康等［18］应用基因表达谱芯片观察小鼠心肌缺血后基因表达的变化以及四逆汤对其的影响。Wachs等［19］发明了一种微型化的离子喷雾装置，适合于与基于芯片的分离装置、多孔或带有待测样品残渣的表面联用，帮助人们对芯片分离所得样品或多孔板中样品进行质谱检测。
       2.6  植物细胞工程实施药用植物的细胞工程，可以利用生物反应器对植物细胞组织大规模培养，通过一系列的单元操作和有效的细胞程序调控，提高中药有效成分含量，通过对有效成分含量的标准化，可提供与天然中药材具有相同药理作用的中药原料产品。其次，还可运用植物细胞工程技术分离和提取中药有效成分，解决原料(栽培)质控、安全性和有效性等问题，使中药产品的技术含量高，质量可控， 疗效确切， 易于制备各种现代制剂。植物细胞工程有助于实现中药生产标准化，实现濒危珍稀中药材和具有较高临床价值的现代中药产品的二次开发。目前，已从400多种药用植物中建立了组织和细胞培养物，分离出600多种代谢产物。我国许多药用植物如人参、丹参、甘草、黄连等的细胞培养都获得了成功，人参、新疆紫草细胞培养技术接近国际先进水平，已经工业化和商品化。姜海英［20］报道，人参通过组培生长25 d后，人参皂苷含量高达3.5％～6.0％ ，药效相当于6龄参。中科院生化过程工程研究所成功培养了紫杉醇、紫草宁、麻黄碱、雪莲、藏红花等10余种药用植物及代谢产物，还在微型薯、青蒿发根转化苗反应器培养方面获得了成功［21］。美国Phyto公司已达到75 000 L紫杉醇的生产规模。此外，毛状根和不定根组织培养也很成功，培养的黄芪毛状根的效价与药用黄芪类似，丹参毛状根的培养物含有7种丹参碱。并能分泌到培养基中。希腊毛地黄细胞在褐藻酸盐的固定化下培养，可将有毒物质毛地黄苷转化为地高辛，利用紫草细胞培养技术生产紫草宁等［22］。依据野生新疆雪莲的抗炎、抗辐射等作用，有人［23］进行了细胞培养物与天然新疆雪莲抗炎、镇痛和抗辐射的药理实验，表明新疆雪莲细胞培养物可以成为野生新疆雪莲的替代品，具有深入开发应用的价值。
       2.7  发酵工程中药发酵研究始于20世纪80年代，人工条件下利用细胞的快速增殖与次生代谢产物的产生，为人工资源的生产提供技术平台。水蛭素不与血小板反应,在治疗血小板减少症（HIT）方面具有其它抗凝药物无法比拟的效果。在5L发酵罐中重组毕赤酵母能够高密度发酵产生水蛭素,最高总产量1.8 g/L, 为大规模工业化铺平了道路［24］。周晓燕等［25］用经选育的猪芩PU-99菌作生产菌株，在1t罐中生产，菌丝体干重2.3％，含粗多糖31％。利用微生物生长代谢来炮制中药，比一般的物理或化学炮制手段优越，可较大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，为中药活性成分结构修饰提供新途径，产生新药效，扩大适应症，保护中药活性成分免遭破坏，节省药源。
       　3  总结
       中药现代化关键在“标准”，中药质量标准化是一项复杂的系统工程，涉及药材的种质基因、生态环境、栽培驯化技术及采收、加工、贮运、制剂工艺等复杂因素。因此，我们要用各种现代分析技术，建立既达到国际标准，又符合中药实际状况，有中药自身特色的质量标准评价体系，使之科学化、标准化，确保临床用药的安全性、有效性，促进现代中药制药工业的发展。当然，我们不能盲目崇尚化学药品的标准要求，而是应结合西药的高新技术挖掘、加强中药复方的稳定性、可控性。目前，我国正全面实施中药材生产质量管理规范(GAP)、药品生产质量管理规范(GMP)、药物非临床研究质量管理规范(GLP)、药物临床试验质量管理规范(GCP)和药品经营质量管理规范(GSP)，以规范中药研究、开发、生产和流通各个过程，提高其行业的标准化水平。上述技术都是从分子水平阐述中药及其复方的作用机理，保护中药的种质资源与基因资源，研发中药新药以及中药材的现代鉴定等。可以根据不同品种的生产要求，自动化控制和在线监测，利用超临界二氧化碳萃取技术、膜技术、大孔树脂吸附、纳米科技等高新技术实现药品质量的稳定和可控。另外，还可应用蛋白质重组等高通量技术研究其作用的分子机制，从蛋白质图谱的变化中寻找中药靶点和途径，以利于新药研发和中药的二次开发。生产技术现代化是中药现代化的重要方面，应结合GMP认证工作，加强企业技术改造，使中药生产从传统方式向现代化生产方式转变。随着中医药在防治“非典”中发挥的独特作用，“回归自然”热潮兴起，但我国中药却因为缺乏科学标准而难以进军国际市场。中药不仅面临国内外市场的激烈竞争，还将遭到资源流失和知识产权丢失的威胁。所以我们必须全面提高中药的技术含量，研发出高质量的中药新药。一般采用两种思路，一是从中药材中提取有效成分的单体成分，将这些单体成分以一定的配伍方式制成制剂；二是从中药材中全面提取所有成分，去除非药效的物质(蛋白质、鞣酸、树脂等大分子及重金属、砷、草酸等小分子)，利用中药经验原方配伍原则，发挥植物自身优势。这两种思路目前都在进行。总之，进行中药现代化，关键是将传统优势与现代医学理论和高新科技结合，提高传统中成药各个生产环节的科技成分，应用现代生物技术，在中药的作用机理、新技术、质量标准等方面深入研究。
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       基金项目：河南省教育厅自然科学指导性计划项目：郑州大学“引进博士基金”，2004年度郑州大学青年骨干教授资助计划基金资助项目（No.200510459067）
       (郑州大学，河南 郑州  450001)