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       【关键词】  鱼腥草；,,指纹图谱；,,聚类分析；,,毛细管气相色谱；,,道地性
       摘要：目的建立鱼腥草挥发油的指纹图谱，为含鱼腥草中药制剂指纹图谱奠定基础。方法采用水蒸气蒸馏法提取不同产地鱼腥草的挥发油；用毛细管气相色谱技术测定指纹图谱(GCFPS)；选用聚类法分析结合含量比较判断其道地性结果该方法灵敏度高，稳定性、重现性的RSD＜3%。结论 该指纹图谱方法简便，重现性好，可作为鱼腥草药材的质量控制方法。
       关键词：鱼腥草；  指纹图谱；  聚类分析；  毛细管气相色谱；  道地性
       Study on GCFPS of Volatile Oil of Houttuynia cordatd Thunb. and its Genuineness
　　
　　WANG Yuhong， ZHANG Shuihan， CAI Guangxian
       （Hunan Institute of Traditional Materia Medica, China; Hunan College of Traditional Chinese Medicine, Changsha,Hunan 410007,China）
       Abstract：ObjectiveTo develop the chromatographic fingerprint for the characteristic of the volatile components of Houttuynia cordatd Thunb.. MethodsVolatile components of Houttuynia cordatd Thunb. from different regions were extracted by steam distillation , and the chromatographic fingerprints were characterized by the capillary gas chromatography. The fuzzy cluster and determination were selected to compare the genuineness. ResultsThis method gave high sensitivity, reproduction and RSD was no more than 3 %. ConclusionAn analysis of the combination of chromatographic fingerprint and fuzzy cluster is convenient and accurate. It is suitable for the quality control of Houttuynia cordatd Thunb..
       Key words：Houttuynia cordatd Thunb.;  Fingerprint;  Capillary gas chromatography;  Fuzzy cluster;  Genuineness
   
　　鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia  cordata  Thunb．的干燥地上部分，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效，用于肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒等症，因其良好的药理作用，被广泛应用于临床。现代研究表明鱼腥草主要有效成分为其挥发性物质，甲基正壬酮(methyl2 n2nonyl2ketone) 、鱼腥草素(decanoyl acetaldehyde) 、月桂烯(myrcene) 等成分［2］。本文采用气相色谱法建立鱼腥草药材的指纹图谱，结合甲基正壬酮的含量对该指纹图谱的特征峰数据进行系统聚类分析和相似度评价，为鱼腥草的质量控制提供科学依据。
       　　1   仪器与试剂
 
　　SP-6890气相色谱仪（山东鲁南），OV-17毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm，中科院），CT-1A氮、氢、空气发生器（武汉科林分析技术研究所）。 甲基正壬酮对照品（中国药品生物制品检定所，编号：08349501），正十五烷（色谱纯），正己烷（分析纯）。10批鱼腥草药材来源见表1。
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱条件与系统适用性实验OV-17毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm），汽化室温度200℃，FID检测器温度210℃，升温程序为：柱室初始温度60℃保持4 min，以2℃/min升温至100℃，保持2 min，再以3℃/min升温至130℃，保持2 min，再以1℃/min升温至140℃，保持2 min，再以10℃/min升温至230℃，保持1 min。分流比1∶50，柱头压0.05 Mpa，尾吹压0.04 Mpa。
       2.2  参照物溶液的制备取正十五烷适量，精密称定，加用正己烷制成每毫升含5 mg的溶液，作为内标溶液。
       2.3  对照品溶液的制备取甲基正壬酮对照品26 mg精密称定，置10 ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
　　
　　2.4   供试品溶液的制备取本品75 g，研细，参照挥发油测定法（《中国药典》2005年版Ⅰ部附录XD甲法）蒸馏提取挥发油，自测定器上端加水使充满刻度部分，再加正己烷1 ml，连接回流冷凝管，缓缓加热至沸，并保持微沸4 h放置30 min，取正己烷层置2 ml容量瓶中，加内标溶液50 μl，加正已烷稀释至刻度，即得。
       表1  鱼腥草样品来源（略）
       2.5   样品的测定分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液与供试品溶液各1 μl，注入气相色谱仪，测定，记录60 min，即得。以正十五烷色谱峰的保留时间为1计算相对保留时间，计算，即得。
       2.5.1  空白实验取内标液1.0 μl，进色谱仪。见图1。
       2.5.2  阳性对照实验取甲基正壬酮对照液1.0 μl，进色谱仪。见图2。取1 μl供试液进气相色谱。见图3。
       图1  溶剂+内标（略）
       图2  内标+对照品（略）
       图3  鱼腥草药材供试液（略）
       2.6  方法学研究
       2.6.1  标准曲线的绘制分别吸取上述对照液0.1，0.5，0.75，1，1.5 ml，用正己烷定容至5.00 ml，摇匀。分别进样1 μl，测定各组分的保留时间和峰面积。以甲基正壬酮的质量为Y，甲基正壬酮的峰面积与正十五烷内标物的峰面积之比为X，进行线性回归分析，得回归方程为：Y=1.157X-0.03（r=0.999 2）。
       2.6.2  精密度实验取同一份鱼腥草的供试品溶液连续进样5次，比较共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD＜3%，符合指纹图谱的检测要求。
       2.6.3  重复性实验取同一批鱼腥草样品5份，按供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液，比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD＜3%，符合指纹图谱的检测要求。
       2.6.4   稳定性实验取同一份鱼腥草的供试品溶液，分别在制备后1，4，8，16，24，48 h进样，比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD＜3%，样品在48 h内稳定，符合指纹图谱的检测要求。
       2.6.5  吸取内标溶液与对照品溶液1 μl，分别注入气相色谱仪，计算校正因子。分别每个批号的样品进样1.0 μl。结果见表2。
       表2  10批鱼腥草样品的含量测定结果（略）
       2.7  指纹图谱的建立
       2.7.1  共有指纹峰的标定共有指纹峰的相对保留时间  采用相对保留时间标定共有指纹峰：以图谱中标正十五烷为参照物（s），将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算10批鱼腥草样品的指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其中12个色谱峰为样品共有，见表3～4。特标定它们为共有指纹峰。结果见图4。以图谱中正十五烷为参照峰（S），计算其它共有指纹峰的相对保留时间：峰1（0.201 6~0.246 4），峰2 (0.270 0~0.330 0)，峰3 ( 0.284 4~0.347 6)，峰4 (0.342 0~0.418 0)，峰5 (0.398 7~0.487 3)，峰6 (0.508 5~0.616 0)，峰7(0.603~0.737), 峰8（0.648 0~0.792 0），峰9 (0.664 2~0.818 8)，峰10(0.783~0.957），峰11 (0.794 7~0.971 3)，峰12 (1.000)。
       表3  10批鱼腥草的相对保留时间（略）
       表4   10批鱼腥草样品共有指纹峰的相对峰面积（略）
       2.7.2  共有指纹峰的相对峰面积以图谱中内标正十五烷为参照物（s），将各共有指纹峰峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较，其比值为各共有指纹峰的相对峰面积。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》的规定［1］，单峰峰面积占总峰面积>10%时，标定其峰面积比值。结果见表4。
       2.8  系统聚类分析  应用SPSS软件对10批鱼腥草样品的HPLC-FP中各特征峰的相对峰面积进行分析，以欧氏平方距离为测度的聚类图。结果见图5。
       图5  系统聚类分析图（略）
       通过系统聚类分析，鱼腥草样品HPLC-FP的特征峰数据的系统聚类结果5，8号样品为道地药材样品，质量均较好。系统聚类结果与表1中不同产地及市售的鱼腥草样品中甲基正壬酮的含量结果相吻合，以湖南道地产区的药材样品为好。
       　　3  讨论
       3.1  由于我国幅员辽阔，鱼腥草生长地域广泛，不同居群、不同生长季节及不同部位的有效成分含量有很大区别。因此，不同产地、不同市场收集的鱼腥草药材中甲基正壬成酮成分参差不齐。为保证药材的质量，宜固定基源，选择道地药材。
       3.2  色谱柱的确定  分别用SE-30（30 m×0.32 mm×0.5 μm），SE-54（30 m×0.32 mm×0.5 μm），OV-17（30 m×0.32 mm×0.5 μm）三种色谱柱对鱼腥草挥发油进行指纹图谱分析。结果表明以OV-17柱对鱼腥草挥发油成分分离最好。
       3.3  程序升温条件的确定  采用如下3种程序升温条件对鱼腥草挥发油进行指纹图谱分析：条件1：气化室温Tj=260℃，柱室温度TO=120℃，氢火焰温度TD=260℃；升温程序：120℃保持2 min，以4℃/min升到160℃，保持2 min，再以2℃/min升到180℃，保持2 min，再以2℃/min升到200℃，保持2 min，以3℃/min升到230℃，保持2min，最后以3℃/min升到260℃，保持5 min；分流比1∶50。条件2：气化室温Tj=260℃、柱室温度TO=120℃，氢火焰温度TD=260℃；升温程序：120℃保持2 min，以2℃/min升到160℃，保持2 min，再以1℃/min升到180℃，保持2 min，再以1℃/min升到200℃，保持2min，最后以2℃/min升到240℃，保持2 min，分流比1∶50。条件3：气化室温Tj=260℃，柱室温度TO=100℃，氢火焰温度TD=260℃；升温程序：100℃保持2 min，以2℃/min升到240℃，保持9 min，再以1℃/min升到180℃，保持2 min，再以1℃/min升到200℃，保持2 min，最后以2℃/min升到250℃，保持5min；分流比1∶50。对3种不同程序升温条件下的鱼腥草的指纹图谱进行比较，结果表明：以条件2为好，故确定条件2为鱼腥草指纹图谱气相色谱分析条件。
       3.4  指纹图谱分析时间的确定  按条件2程序升温，在终温的基础上再保持60 min。结果表明：在程序升温结束后,无成分残留，故确定鱼腥草指纹图谱的分析时间为90 min。
       参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：155.
       ［2］  于健东,胡玉霞,田金改，等.鱼腥草中甲基正壬酮的含量测定［J］.药物分析杂志, 1999,19 (1) ：50.
       项目基金：湖南中医药管理局资助课题（No.24303）
       (湖南中医药研究院，湖南 长沙  410006；湖南中医学院第一附属医院，湖南 长沙  410007)