榛花的降血糖作用及其机制的实验研究
作者： 蔡英兰，金香子，李善花，朴丽花，李佳
《时珍国医国药》 2005年 第11期
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【关键词】 榛花
摘要: 目的: 观察榛花的降血糖作用并初步阐明其作用机理。 方法: 采用四氧嘧啶所制实验性糖尿病小鼠模型，以对照方法测定血糖、血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量并观察肝糖原和胰岛B细胞。 结果: 榛花可降低实验性糖尿病小鼠的血糖水平，可提高血清SOD活性并降低血清MDA含量，可提高肝糖原含量，而未能使胰岛B细胞修复和再生。 结论: 榛花具有降低实验性糖尿病小鼠高血糖的作用，而这种作用可能是通过促进肝组织糖原合成等类胰岛素样作用和清除自由基及抗脂质过氧化过程实现的。
关键词: 榛花; 降血糖; SOD; MDA; 组织化学; 免疫组织化学
The effects and mechanisms of hazel"s flower on decreasing blood sugar
CAI Y ing-lan， JIN X iang-zi， LI SH an-hua， PIAO L i-hua， LI J ia
Department of histology and Embryology，Medical College of Yanbian University（Yanji133000，jilin，China）
Abstract: Objective:to observe the effects of hazel"s flower on decreasing blood sugar and clarify its mechanisms.Methods:by the mouse of experimental diabetes induced by alloxan，by the methods of control，it was measured the blood sugar，activity of superoxide dismutase（SOD）of serum，amount of malondialdehyde（MDA）of serum and observed hepatic glycogen and pancreas islet B cell.Results:The hazel"s flower decreased the lever of the blood sugar and the amount of MDA，and increased the activity of SOD and the contents of hepatic glycogen，but could not make the pancreas islet B cell repaired and regenerated.Conclusion:The Hazel"s flower had the effect of decreasig blood sugar on diabetic mouse induced by alloxan May be its mechanism of decreasing blood sugar was the insulin kind function of promoting synthesis of hepatic glycogen etc，clearancing free radicals and process of anti-lipid peroxidation.
Key words: words:hazel"s flower; Decrease blood sugar; SOD; MDA; Histochemistry; Immunohistochemistry
榛属桦木科植物，分布在东北、华北等地，据《中药大辞典》记载，榛的种仁即榛子有调中、开胃、明目，治病后体虚等作用［1］ 。2000年美国俄勒冈波特兰大学的化学家Angela Hoffman［2］ 报导榛木树的叶子、小枝和果实中含有有抗癌作用的Paclitaxel（泰素）。而目前为止，国内外对榛花的研究报导甚微，2001年南征等人［3］ 首次报导榛花有解毒和降糖作用，但缺乏系统的实验研究佐证。为此，本实验通过生化检测、组织化学、免疫组织化学等研究方法观察了榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠的降糖作用，并初步探讨了其降糖机制。
1 材料
1.1 实验动物
成年昆明种雄性小鼠，体重（20±2）g，由延边大学医学院资产处动物科提供。
1.2 药品与试剂
榛花:春季采集东北自然生长的榛花，由延边大学长白山天然药物开发研究中心采用水提法提取（榛花780g加蒸馏水煮30～60min，过滤后浓缩至200ml，灌封备用）;盐酸二甲双胍片:贵州圣济堂制药有限公司产品，批号20020109;四氧嘧啶:HONG KONG FARCO Chemical Supplies产品批号42011―3E;血糖试剂盒:中生北控生物科技股份有限公司产品，批号24011;SOD试剂盒:南京建成生物工程研究所产品，批号20030123;MDA试剂盒:南京建成生物工程研究所产品，批号20030107;兔抗小鼠Insulin免疫组化染色试剂盒:天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品。
1.3 主要仪器
芬兰MK-3型酶标仪;德国ZK15型超低温离心机;德国Leica820型组织切片机;日本Olympus VANOX型万能显微镜;北京天地百年科技有限责任公司TD-2000型真彩病理细胞显微分析系统。
2 方法
2.1 四氧嘧啶性糖尿病小鼠模型的制备 实验用成年雄性昆明种小鼠体重（20±2）g先适应性喂养1周后，禁食24h，自由饮水。将四氧嘧啶用生理盐水配成0.7%注射液，每只小鼠按70mg/kg尾静脉一次性注射。注射后第5天测空腹血糖，空腹血糖值大于10.00mmol/L者纳入糖尿病模型［4，5］ 。
2.2 动物分组及处理
正常小鼠10只为正常对照组，糖尿病小鼠50只按血糖高低随机分为5组，分别为模型对照组、药物对照组、实验组（大、中、小剂量组）。实验期间各组小鼠均给予块料喂养，实验组每日分别灌服榛花浓缩液5ml/kg（大剂量组），2.5ml/kg（中剂量组），1.25ml/kg（小剂量组）;药物对照组每日灌服盐酸二甲双胍1g/kg;模型对照组和正常对照组每日灌服相应体积的蒸馏水。实验周期为3周。
2.3 生化检测
实验前及实验后，实验动物禁食12h后分别取眼眶静脉窦血，分离血清，应用血糖、血清SOD、MDA试剂盒分别测空腹血糖、血清SOD活性、MDA含量。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，血清SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。
2.4 组织化学观察
实验结束后将小鼠脱颈处死，迅速剖取肝脏，将肝组织在4℃Carnoy氏液中低温固定6～8h，经上行酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切成5μm切片，做过碘酸雪夫氏（PAS）反应显示肝糖原［6］ 。
对照实验:用唾液消化肝组织中的糖原后，再做PAS反应。染色后用OLYMPUS万能显微镜观察拍片并利用病理显微分析系统进行定量分析（每组随机选3张标本，每张标本再随机选3个视野，在X400下，测定每个视野糖原颗粒面积百分比）。 2.5 免疫组织化学观察 实验结束后将小鼠脱颈处死，迅速剖取胰尾，将胰尾组织在Bouin氏液中固定12h，经上行酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切成5μm切片，分别做HE染色与免疫组织化学染色显示胰岛及胰岛B细胞，免疫组织化学染色采用高敏链霉亲和素（SABC）法
［7］ 。
实验后用OLYMPUS万能显微镜观察拍片，并利用病理显微分析系统进行定量分析（每组随机选3张标本，每张标本再随机选3个视野，在X400下，测定每个视野胰岛B细胞密度）。
2.6 数据处理
应用SPSS（Statistical Paclcage for the Social Sciencl）10.0统计软件处理，实验前后之间进行配对t检验，各组间进行方差分析。
3 结果
3.1 生化检测结果
3.1.1 榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠血糖水平的影响 表1 各组实验前后及各组间血糖水平比较 （x 略）
3.1.2 榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠血清SOD活性的影响 表2 各组间血清SOD活性比较 （略）
3.1.3 榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠血清MDA含量的影响 表3 各组间血清MDA含量比较 （略）
3.2 组织化学观察:榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠肝细胞糖原含量的影响 肝糖原经PAS反应染色后，在光镜下呈紫红色颗粒。正常对照组肝糖原颗粒含量丰富，染色深。模型对照组肝细胞糖原颗粒含量明显减少，染色浅。药物对照组与实验大、中、小剂量组肝细胞糖原颗粒含量明显增多，染色较深，其中以实验大剂量组的变化最为明显，接近正常对照组。肝糖原定量统计分析结果: 表4 肝糖原定量分析结果 （略）
3.3 免疫组织化学观察 榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠胰岛B细胞的影响。SABC法染色后，胰岛B细胞分泌的胰岛素与胰岛素特异性抗体结合，呈棕黄色颗粒。正常对照组胰岛多为圆形或椭圆形，大小不一，形态完整，胰岛B细胞占胰岛绝大部分，位于胰岛中央，呈免疫反应阳性的棕黄色胰岛素分泌颗粒分布在细胞质内，颗粒含量丰富，较致密，着色深。模型对照组胰岛形态多不规则，且不完整，边缘不整齐，B细胞数量明显减少，多数B细胞胞质内棕黄色胰岛素分泌颗粒明显减少，着色浅，有的胰岛则无B细胞。药物对照组和实验组的免疫组织化学染色结果与模型对照组相比，胰岛B细胞数量相近，细胞质内颗粒分布、着色也相近。胰岛B细胞定量统计分析结果:表5 胰岛B细胞定量分析结果 （略）
4 讨论
糖尿病的病因尚未阐明，但目前认为胰岛素绝对或相对不足或胰岛素抵抗是糖尿病的主要病理生理基础。胰岛素的主要作用是促进细胞吸收血液内的葡萄糖作为细胞代谢的主要能量来源，同时也促进细胞将葡萄糖合成糖原或转化为脂肪。胰岛素的这种作用受阻、胰岛素分泌不足或两者同时存在缺陷，可导致血糖升高。目前，尚缺乏针对病因的有效治疗手段，因此，糖尿病的治疗中最关键的环节还是降血糖。
本实验生化检测结果表明，榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠具有明显的降糖作用。目前已被证实的降糖中药的降糖机制有:促进胰岛B细胞的分泌功能，提高血清胰岛素水平;作用于受体或受体后水平，增加胰岛素受体数目或提高亲合力;抑制胰高血糖素分泌;促进周围组织及靶器官对糖的利用等几个方面。最近，有不少学者认为血糖升高与自由基有着密切关系，而且据很多文献报导某些降糖中药的降糖机制与清除自由基及抗脂质过氧化过程有关［8，9］ 。本实验通过观察榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠的血清SOD活性、MDA含量以及对肝组织和胰岛B细胞的影响等三个方面初步探讨其降糖机制。
4.1 对血清SOD活性、MDA含量的影响
自由基可引发多价不饱和脂肪酸过氧化而生成过氧化脂质（LPO），其最终产物MDA能使蛋白质、核酸、脂类发生交联，使生物膜发生变性，细胞突变、衰老或死亡。体内SOD为直接清除自由基的酶，可阻断自由基促使产生LPO的链式反应，从而保护细胞不受自由基的损害。四氧嘧啶具有产生氧自由基的能力，其致糖尿病作用是由于自由基介导的，而预先注射SOD可以预防四氧嘧啶诱导的糖尿病［10］ 。四氧嘧啶性糖尿病鼠抗氧化防御体系受抑制，自由基产生率大于清除率，而LPO的升高与SOD活性降低呈负相关，同时与血糖升高呈正相关，说明血糖升高与自由基引起的脂质过氧化有直接关系，这与糖尿病患者体内变化相一致［11，12］ 。四氧嘧啶产生的自由基不仅直接损伤胰腺，破坏胰岛B细胞，降低体内胰岛素水平，使血糖升高，而且还累及到其他脏器，比如肝脏，使肝脏糖原合成及葡萄糖利用等功能受抑制，从而进一步加重血糖的升高。本实验生化检测血清MDA含量及SOD活性结果:糖尿病小鼠治疗前，血清MDA含量明显高于正常，血清SOD活性明显低于正常，提示糖尿病小鼠体内自由基增多，脂质过氧化作用增强，而SOD消耗过多，不能有效清除氧自由基，对抗脂质过氧化作用。经3周治疗后，药物对照组、实验大、中、小剂量组的血清SOD活性明显增高，与模型对照组相比P<0.05;血清MDA含量明显减少，与模型对照组相比P<0.05，说明榛花可提高机体SOD的活性，清除自由基，并抑制脂质过氧化作用，同时，本实验肝组织PAS反应结果，实验组肝糖原含量与模型对照组相比明显增多，肝脏合成糖原功能得以恢复。提示榛花可能是通过清除氧自由基及抗脂质过氧化作用，保护肝脏并恢复肝脏正常的糖代谢功能，纠正糖代谢紊乱，降低血糖。
自由基引起的脂质过氧化不仅导致血糖升高，而且，可使很多重要器官遭到伤害，这可能是产生糖尿病并发症的重要原因。榛花可明显提高机体SOD活性，清除自由基，抑制脂质过氧化作用，说明榛花可减轻自由基及其代谢产物对各组织的伤害作用，提示榛花对防治糖尿病并发症方面也可以起到重要作用。
4.2 对肝糖原含量的影响
肝脏是糖代谢最主要的器官之一，主要是通过促进糖原合成及葡萄糖利用、抑制糖异生等途径使血糖降低，而肝脏的糖代谢主要是在胰岛素的诱导下完成的。四氧嘧啶性糖尿病小鼠体内胰岛素水平明显下降，因此，糖尿病小鼠肝脏糖代谢出现紊乱，糖原合成降低、葡萄糖利用减少、糖异生加强，导致血糖升高。本实验组织化学染色结果:模型对照组糖尿病小鼠肝脏肝细胞内糖原颗粒含量明显减少，着色浅，说明糖尿病小鼠肝细胞合成糖原功能明显减弱。经3周治疗后，药物对照组、实验大、中、小剂量组肝糖原含量与模型对照组相比明显增多，着 色也较深，其中实验大剂量组变化最明显，接近正常对照组，表明，榛花能够改善糖尿病小鼠肝内糖代谢紊乱，增强肝细胞合成糖原的功能，从而降低血糖，提示，榛花的降糖作用可能是通过促进肝细胞合成糖原等类胰岛素样作用来实现的。
4.3 对胰岛B细胞的影响
四氧嘧啶是一种特异性B细胞毒剂，可选择性破坏实验动物的胰岛B细胞，引起实验性糖尿病［13］ 。众多实验研究表明，有些中药复方或单味药有刺激实验动物胰岛B细胞分泌胰岛素及促使受损的胰岛B细胞修复和再生等功能［14］ ，从而降低血糖。本实验HE染色及高敏SABC免疫组化染色结果显示，模型对照组糖尿病小鼠胰岛数量减少，形态多不规则且不完整，胰岛内B细胞数量明显减少，颗粒着色浅。经3周治疗后，药物对照组和实验大、中、小剂量组胰岛数量及形态、胰岛B细胞数量及胞质内分泌颗粒与模型对照组相比并没有明显的区别。说明榛花对受损的胰岛B细胞无修复功能。
总之，本实验结果榛花具有降低实验性糖尿病小鼠高血糖的作用，而这种作用可能是通过促进肝组织糖原合成等类胰岛素样作用和清除自由基及抗脂质过氧化过程实现的。
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作者简介: 蔡英兰（1972-），女（朝鲜族），吉林珲春人，现任延边大学医学院基础医学系讲师，硕士学位，主要从事组织化学研究.
（延边大学医学院组织学与胚胎学教研室，吉林延吉 133000）
收稿日期: 2005-02-03