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       【关键词】  复方苦参注射液；,,细菌内毒素；,,动态浊度法；,,干扰实验
       摘要：目的建立定量检测复方苦参注射液中细菌内毒素实验方法。方法采用《中国药典》2005年版（Ⅲ部）附录检测细菌内毒素的动态浊度法。结果复方苦参注射液用细菌内毒素定量法检测无干扰因素影响，内毒素回收率在50%~200%范围内。结论 使用动态浊度法定量检测复方苦参注射液的细菌内毒素是可行的，可用细菌内毒素方法代替兔热原检查法，同时又避免了限量法内毒素检测时的干扰。
　　
　　关键词：复方苦参注射液；  细菌内毒素；  动态浊度法；  干扰实验
       Application of the Turbidimetric-Kinetic Method for the Measurement of Endotoxin in Composite Radix Sophora Flavescentis Injection
       LIU  Yuan，KONG Wei
       (Zhenjiang Institute for Drug Control, Zhenjiang 212003，China； The First Hospital of Zhenjiang, Zhenjiang 212003,China)
       Abstract：ObjectiveTo develop an assay for determination of bacterial endotoxin(BET) in Composite Radix Sophora Flavescentis Injection.MethodsBET was determined by turbidimetrickinetic method. ResultsThe content in Composite Radix Sophora Flavescentis Injection did not interfere with the quantitation of BET.The recovery of BET was between 50% and 200%.ConclusionThe method is proved to be suitable for determination of the BET in Composite Radix Sophora Flavescentis Injection and could be used as an alternative for  the rabbit pyrogen test to the injection.
       Key words：Composite Radix Sophora Flavescentis Injection;  Bacterial endotoxin;   TurbidimetricKinetic method;  Interfere factors test
   
　　复方苦参注射液是苦参和白土芩溶液提取物的灭菌溶液，具有清热利湿，凉血解毒，散结止痛的功能。目前我国药品标准对注射剂采用家兔法进行热原检查。但复方苦参注射液临床用量大，且为中药制剂，采用家兔法进行热原检查操作复杂，影响因素多，而细菌内毒素限值检查又具有较大的干扰性，故选用动态浊度法测定其细菌内毒素可消除其干扰，结果准确可靠，且对复方苦参注射液进行添加内毒素回收试验及热原检查的对比实验，以建立此分析方法。
       　1  材料与仪器
       复方苦参注射液（批号20060203；20060607；20050923；20060116，山西金晶药业有限公司）；TAL试剂（批号20060208，λ=0.03EU・ml-1，规格0.5 ml・Amp-1，湛江海洋生物制品检定厂）；细菌内毒素国家标准品（批号2006-3，70EU・Amp-1，中国药品生物制品检定所）；细菌内毒素检查用水（批号20060208，规格10 ml・Amp-1，湛江海洋生物制品检定厂）；BET32C 细菌内毒素测定仪（天津大学无线电厂）。
       　2  方法与结果
       2.1  细菌内毒素限值的确定［1］公式为：L=K・M-1，K为规定的给药途径，即人每公斤体重每1h最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5.0 EU・kg-1；M为1 h每千克体重人的最大给药剂量为0.005 ml・kg-1，计算得样品的内毒素限值L为0.5 EU・ml-1。
       2.2   标准曲线制备及可靠性［1］用细菌内毒素检查用水将内毒素国家标准品进行10及2倍稀释，最终细菌内毒素浓度分别为0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 3  EU・ml-1稀释系列；各取0.1 ml分别加到预先加有0.1 ml TAL试剂反应管内，混合均匀，立即插入BET32C细菌内毒素测定仪内进行自动检测，其中每一个浓度重复3管。结果见表1。回归方程：lgT=2.928-0.3037 lgC，其中相关系数r=-0.997 8；最低浓度λ1=0.031 3 EU・ml-1，空白对照管在检测时间外，故标准曲线成立。
       表1  标准曲线的可靠性（略）
       2.3  干扰实验
       2.3.1   样品稀释倍数计算［1］公式为MVD=L・C・λ1-1。L为复方苦参注射液内毒素限值；C为1.0ml・ ml-1；λ1为标准曲线的最低内毒素浓度0.0313 EU・ml-1；计算得复方苦参注射液最大有效稀释倍数MVD为16倍。
       2.3.2   样品溶液配制及干扰实验  将复方苦参注射液用内毒素检查用水依次稀释为2，4，8，16倍溶液，记为Ai液；同时另取4管，进行同样倍数稀释，但在稀释液中添加浓度为M（4λ1）的细菌内毒素标准溶液；作为样品添加内毒素阳性对照管，记为Bi液；分别取上述各液0.1ml，加入预先加有0.10 ml TAL试剂的反应管内，混匀立即插入BET-32C细菌内毒素测定仪内进行检测，其中每一个浓度重复3管，计算回收率。回收率（%）=（Bi液内毒素值-Ai液内毒素值）×M-1×100%。结果见表2。
       表2  复方苦参注射液的干扰实验（略）
       标准曲线：lgT=2.928-0.303 7 lgC，r=-0.997 8。样品的添加内毒素平均回收率均在50%~200%范围内，符合《中国药典》2005年版规定，表明样品的4个浓度溶液对鲎试剂无干扰影响。
       2.4   样品溶液正式实验分别取4批复方苦参注射液，用细菌内毒素检查用水制成4倍稀释液，记为Ai液；同时另取4管进行4倍稀释，并在稀释液中添加浓度为M（4λ1）的细菌内毒素标准溶液，记为Bi液；分别取上述各液0.1 ml，加入预先加有0.10 ml TAL试剂的反应管进行检测，其中每一个浓度重复3管，计算回收率。结果见表3。
       表3  复方苦参注射液正式干扰实验（略）
       标准曲线：lgT=2.928-0.303 7 lgC，r=-0.997 8，4批复方苦参注射液的回收率均在50%~200%范围内，表明复方丹参注射液在本实验条件下对TAL试剂无干扰影响，因此日常检验选用4倍即可。同时进行4批供试品的家兔热原检查对比实验，结果一致，均为阳性。
       　　3  讨论
       3.1  从复方苦参注射液的干扰实验结果发现：复方苦参注射液用细菌内毒素动态浊度法检测，由于内毒素回收率在50%~200%范围内，表明不存在干扰因素影响，且4批复方苦参注射液的内毒素含量均在规定限度0.5 EU・ml-1以下。
       3.2  用传统的家兔法检测细菌内毒素，由于操作复杂，影响因素多，对试验结果影响很大。利用动态浊度法进行细菌内毒素定量检测，具有操作简便，结果准确，检测灵敏度高等优点，尤其避免了由于家兔差异及人为主观判断所出现的假阳性或假阴性结果。经过对比实验，样品的细菌内毒素定量检测结果与家兔热原检测结果一致，说明使用细菌内毒素动态浊度法测定复方苦参注射液的细菌内毒素是可行的，可用细菌内毒素定量检查法代替家兔热原检查法。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅲ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录XIXF.
       (江苏省镇江市药品检验所  212003；  江苏省镇江市第一人民医院  212003)