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       【关键词】  蜂胶提取物；,,小鼠；,,免疫功能
       摘要：目的观察蜂胶提取物对荷瘤小鼠免疫系统的影响。方法通过将荷瘤小鼠移植S180肉瘤，观察蜂胶提取物对荷瘤小鼠NK细胞活性，淋巴细胞增殖以及淋巴细胞IL2诱生的影响。结果蜂胶提取物对NK细胞杀伤活性有明显增强作用，能够显著提高淋巴细胞增殖能力和IL2的含量（P＜0.01）。结论 蜂胶提取物能够显著提高荷瘤小鼠免疫系统的活性。
       关键词：蜂胶提取物；  小鼠；  免疫功能
       Effect of Ethanol Extract from Propolis on Cell Immunity of Tumorbearing Mice
       PAN Ming
       (Department of Bioengineering，Sichuan Institute of Science and Technology，Zigong 643000，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the influence of ethanol extract from propolis on celular immunity of mice bearing tumor．MethodsEffect of ethanol extract from propolis on NK cells reactive, lymphocyte proliferation and lymphocyte IL2 lured health of tumorbearing mice were observed by transplanting S180 sarcoma from tumorbearing mice．ResultsEthanol extract from propolis could strengthen NK cell antireactive，increase lymphocyte proliferation and the content of IL2（P ＜0.01）．ConclusionEthanol extract from propolis can significantly improve the immunity activity of mice bearing tumor．
       Key words：Ethanol extract from propolis；  Mice；  Immune function
   
　　蜂胶是蜜蜂巢中的一种树脂状物质，含有多种化学成分，有研究者提出其中的黄酮类、槲皮素、多糖等具有抗肿瘤及免疫调节等功效［1～3］。在对其免疫增强作用的系统研究中发现，蜂胶提取物能够刺激免疫机能和丙种球蛋白活性，增加抗体生成量，增强巨噬细胞的吞噬能力，从而提高机体抵抗力、抑制癌细胞生长［4～8］。本实验对蜂胶提取物抗肿瘤及其作用机制进行了初步研究，现报告如下。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  动物昆明种标准小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由四川大学动物实验中心提供；BalB/C纯种小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由成都中医药大学动物中心提供。
       1.1.2   蜂胶提取物由本实验室制备，将蜂胶粗品用80%的乙醇提取，回收乙醇，浓缩而得。
       1.1.3  肿瘤细胞株S180肉瘤，经小鼠腹腔传代保种，由生命科学学院试验室提供。L929细胞，由生命科学学院实验室提供。
       1.1.4  主要试剂与仪器   RPMI1640；小牛血清；胎牛血清；a甲基甘露糖苷（amm）；刀豆蛋白A(ConA)；Sigma产四甲基偶唑蓝(MTT)；CO2培养箱；酶标仪。
       1.2  实验方法［9］  菌取传代6 d的S180肉瘤细胞悬液，经生理盐水稀释后调细胞数至4×107/ml，每只小鼠腋下接种0.2 ml，24 h后随机分组：蜂胶提取物组小鼠每天按0.1 ml/10 g体重腹腔注射蜂胶提取物(15 mg/ml)，1次/d，连续7 d，荷瘤模型组小鼠每天按0.1 ml/10 g体重腹腔注射生理盐水，环磷酰胺（CY）组小鼠每只每天腹腔注射环磷酰胺0.4 mg/ml，途径、方法、次数同蜂胶提取物组，另设正常对照组小鼠注射生理盐水，途径、剂量、方法同荷瘤模型组，于接种肿瘤后第12天各组小鼠分别颈椎处死取脾进行以下实验。
       1.2.1  NK细胞杀伤活性的测定 小鼠脾脏NK细胞的获得：常规方法制备脾细胞，计数，调细胞数至1×107个/ml，即为备用的NK细胞。靶细胞：传代培养的L929细胞在试验时用0.25％胰蛋白酶消化1～2 min，加完全1640培养液轻轻吹打细胞，离心将细胞重悬于含10%小牛血清的1640培养液中，调细胞数至2×105个/ml，即为备用的NK细胞的靶细胞。NK细胞活性的测定：取事先配好的靶细胞悬液加入96孔板中，0.1 ml/孔，然后培养箱中培养1 h，向每孔加入0.1 ml效应细胞（使效靶比例50：1），靶细胞对照孔加完全1640  0.1 ml，各设4个复孔，再放入培养箱中培养20 h，MTT法检测NK细胞活性。
       杀伤率（%）＝（靶细胞OD值－实验组OD值）     靶细胞OD值×100％
       1.2.2   淋巴细胞增殖反应的测定   常规制备1×107/ml脾细胞悬液，加入96孔培养板，每孔200 μl，实验孔每孔再加50 μg/ml ConA 20 μl。对照孔加培养液20 μl，每个组均设平行孔3孔。培养箱中培养66～72 h，取出培养板。离心取上清100 μl MTT测Ａ值，计算淋巴细胞增殖率。
淋巴细胞增殖率(%)=实验孔A值     对照孔A值×100%
       1.2.3  淋巴细胞IL2诱生与活性测定    IL2样品的制备：常规方法制备1×107/ml脾淋巴细胞悬液，加ConA 5 μg/ml，培养于24孔细胞培养板，在37℃CO2培养箱中温育24 h；离心收集上清液，-20℃保存，即为IL2待测样品。IL2检测细胞的制备：BalB/C小鼠颈椎脱臼处死，常规方法制备5×106/ml脾淋巴细胞悬液，加ConA 2.5 μg/ml，置25 ml的细胞培养瓶中温育96 h。细胞用10 mg/ml a甲基甘露糖苷（a-mm）的Hank"s液洗两次，调节细胞浓度为 1×106/ml，作为测定IL2的反应靶细胞。IL2样品的检测：在96孔细胞培养板中，每孔加反应细胞0.1 ml（1×105个）和等量的IL2上清液，每样均设3个复孔。每孔加100 mg/ml amm 20 μl，在CO2培养箱中温育48 h，用MTT比色法测定结果。
       　　2  结果
       结果表明蜂胶提取物组小鼠NK细胞活性及淋巴细胞增殖能力显著高于荷瘤模型组小鼠（P ＜0.01），环磷酰胺组NK细胞活性及淋巴细胞增殖能力显著低于荷瘤模型组（P ＜0.05），并且蜂胶提取物组小鼠IL2含量也显著高于荷瘤模型组和环磷酰胺组（P ＜0.01）。结果见表1～3。
       表1  蜂胶提取物对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响（略）
       与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与荷瘤模型组比较， △P ＜0.05，△△P ＜0.01;n=10
       表2  蜂胶提取物对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖的影响（略）
       与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与荷瘤模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;n=10
       表3  蜂胶提取物对荷瘤小鼠淋巴细胞产生IL2活性的影响（略）
       与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与荷瘤模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；n=10
       　　3  讨论
       癌症是当今世界危害人类健康最严重的疾病之一，其死亡率居高不下。癌症发生的根本原因是人体免疫功能失调，癌变的细胞逃脱了免疫监视，在体内迅速分裂增殖，形成恶性肿瘤［7］。为了与肿瘤作斗争，各国科学家进行了长期不懈的努力。有科学研究发现，蜂胶是一种天然的免疫强化剂，其提取物具有较好的抗肿瘤活性［7,8］。本实验采用蜂胶提取物初步探讨其对荷瘤小鼠免疫系统的影响。蜂胶能增强Ｔ淋巴细胞的功能，显著提高小鼠脾淋巴细胞的转化，并促使其分泌IL2，IFN-α等免疫活性因子［4,5,8］。本实验结果显示，蜂胶提取物能促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞ConA的增殖反应，说明蜂胶提取物能增强细胞免疫。淋巴细胞在有丝分裂原ConA刺激下，转化为淋巴母细胞，并分化增殖，使细胞内蛋白质和核酸合成增加，多种活性因子的释放也增加，提高了机体的整体抗肿瘤水平［10］。NK细胞是免疫系统固有的重要的淋巴细胞。通过其细胞毒性发挥其抗肿瘤作用［10］。实验结果显示，蜂胶提取物对NK细胞杀伤活性有明显增强作用，可认为蜂胶提取物增强了NK细胞对肿瘤细胞刺激的敏感性，而使NK细胞活性增强。另外，IL2可以激活NK细胞，活化后的NK细胞可直接杀伤肿瘤细胞，也同时释放许多细胞因子如IFN γ，IL2，IFN α，从而扩大抗肿瘤谱［11］。综上所述，蜂胶提取物能提高荷瘤小鼠的细胞免疫功能，发挥其抑瘤作用。但由于组成蜂胶的化学组分十分复杂，其乙醇提取物中虽以黄酮类为主，但也富含多种其他化学成分，仅黄酮类化合物本身就高达70多种［12］。因此，要明确是何种成分在蜂胶提取物中发挥免疫调节作用，还需要大量的实验研究对其进行进一步的探讨。
       　　参考文献：
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       ［12］  郭  伽,周立东.蜂胶的化学成分研究进展［J］. 中国养蜂，2000，51(2)：17.
       (四川理工学院，四川 自贡  643000）