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       【关键词】  红茶菌;,,小鼠;,,免疫功能
       摘要：目的探讨红茶菌对小鼠免疫功能的调节作用。方法Balb/c小鼠30只，体重18～22 g，随机分为两组，用红茶菌液给小鼠灌胃30 d后处死，以MTT法测定NK细胞的杀伤活性；以腹腔巨噬细胞吞噬白色念珠菌的方法评价巨噬细胞吞噬功能；以胸腺细胞增殖法和脾细胞增殖法分别测定IL1和IL2的生物活性。结果红茶菌能显著提高NK细胞的杀伤活性；巨噬细胞吞噬功能明显增强；红茶菌灌胃组IL1和IL2活性分别为：0.549±0.024，0.405±0.018；对照组分别为：0.341±0.021，0.361±0.011，实验组与对照组比较，IL1，IL2活性得到显著提高(P＜0.01)。结论 红茶菌能显著增强小鼠的免疫功能。
       关键词：红茶菌;  小鼠;  免疫功能
       The Effect of Black Tea Fungus on Immunological Function of Mice
       LI Boqing， MENG Wei, WANG Zhiqiang， YU Min， SUN Xuhong
       （Department of Microbiology and Parasitology, Binzhou Medical College, Binzhou 256603，China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the regulative effect of black tea fungus on the immunological function of mice. MethodsThirty Balb/c mice(weight 18～22 g) were randomly divided into two groups. All the mice were sacrificed after they had been given black tea fungus in intragastric administration for thirty days. The killing activity of NK cells were detected by MTT method, and peritoneal macrophage swallowing C. albicans test was used to appraise the phagocytes function. The activities of interleukin 1 and interleukin 2 were separately detected by mouse thymocyte or splenic cell proliferation test.ResultsThe activities of IL-1 and IL-2 of mice were 0.549± 0.024, 0.405±0.018 in experimental group respectively; they were 0.341± 0.021 and 0.361±0.011 respectively in control group. They were significantly higher in experimental group than those in control group (P＜0.01). The killing activity of NK cell and the phagocytes function of the macrophages in vitro were also markedly promoted(P＜0.01).ConclusionThe black tea fungus can enhance the immunological function of mice significantly.
       Key words：Black tea fungus;  Mice;   Immunological function
   
　　红茶菌又称“海宝”或“胃宝”，是在我国民间广为流行的一种保健饮品，为我国传统医药的重要组成部分。前期研究中我们发现红茶菌对小鼠具有显著的抑瘤作用，为进一步探讨其抑瘤机制，我们通过用红茶菌对小鼠进行胃内灌注的方法，观察红茶菌对小鼠免疫功能的调节作用。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物Balb/c小鼠，体重18～22 g，雌雄兼有，引自北京大学基础医学部实验动物研究中心。
       1.2  细胞株K562细胞由北京大学基础医学部免疫系提供。
       1.3  试剂红茶菌，本室保存菌种，总菌数为5.5×107CFU/ml，RPMI1640（Gibco公司），LPS（Sigma公司），白色念珠菌（本室保存），ConA（北京医药站），MTT（Sigma公司），DMSO（国产）。
       1.4  仪器全自动酶标仪（Multiskan MS），CO2培养箱（Forma公司），低速冷冻离心机（IEC公司），电子精密天平（METTLER TOLEDO）。
       1.5  动物分组随机把Balb/c小鼠分为对照组和实验组，各组15只。对照组以自来水0.5 ml/只，实验组以红茶菌0.5 ml/只，每天胃内灌注1次，第30天颈椎脱臼处死小鼠，进行实验观测。
       1.6  MTT法测定NK细胞杀伤活性常规取脾脏制成细胞悬液，用不含血清RPMI1640液洗涤2次，以10%BCS RPMI1640配成1×106个细胞/ml，作为效应细胞；取连续传代培养的K562细胞悬液各100 μl加入96孔平底培养板，再向每孔中加入MTT（5 mg/ml）10 μl，每组设3个平行孔，另设3个效应细胞对照孔（100 μl上述脾细胞加100 μl 10%BCS RPMI1640及10 μlMTT）和靶细胞对照孔（100 μl上述K562细胞加100 μl10%BCS RPMI1640及10 μl MTT），置37℃，5%CO2培养箱中4 h，取出后1 000 r/min，离心10 min，测560 nm处A值，计算NK细胞杀伤活性。NK细胞杀伤活性（%）=实验孔A值效应细胞对照孔A值     靶细胞对照孔A值×100
       1.7  体外巨噬细胞吞噬功能测定各组小鼠于实验第30 d分别腹腔内注射冷RPMI1640液5 ml，轻柔按摩10 s后吸出液体，1 000 r/min离心10 min，弃去大部分上清，留约5 ml，加100 μl白色念珠菌液（1×105CFU）混匀，置37℃恒温培养箱内60 min后混匀涂片，瑞氏染色，计算体外巨噬细胞吞噬百分率［1］。
       1.8  IL1和IL2的诱生与检测
       1.8.1  IL1的诱生无菌操作向小鼠腹腔内注射冷RPMI1640培养液5 ml，轻柔按摩10 s后吸出液体，离心洗涤3次，调整细胞浓度为2×106/ml，加入有丝分裂原LPS（10 U/ml），置37℃，5%CO2培养箱内诱导36 h，离心取上清为IL1［2］ ，置-20℃冰箱保存备用。
       1.8.2  IL1的检测   无菌操作取正常Balb/c小鼠胸腺，制成1×107/ml细胞悬液，取细胞悬液及待检上清各100 μl加入96孔细胞培养板中，置37℃5%CO2培养箱中72 h。培养结束时行1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入200 μl DMSO，在全自动酶标仪波长为560 nm处测定其A值，表示IL1的活性。
       1.8.3  IL2的诱生   无菌操作制备小鼠脾细胞悬液，用RPMI1640液离心洗涤（1 000 r/min，10 min）3次后以10%BCS RPMI1640配成5×106/ml，取100 μl加入96孔细胞培养板内，加入ConA（5 μg/ml），置37℃ 5%CO2培养箱内诱导36 h，离心取上清为IL2［2］，置-20℃冰箱保存备用。制备活化脾淋巴细胞：按上述方法取正常Balb/c小鼠脾脏，制成5×106/ml细胞悬液，加入ConA（5 μg/ml），置37℃ 5%CO2培养箱内培养48 h，收集细胞，离心洗涤3次，用RPMI1640液配成5×106/ml细胞悬液，作为检测IL2的反应细胞。
       1.8.4  IL2活性检测取-20℃冰箱保存的IL2上清及上述反应细胞各100ul加入96孔平底细胞培养板中，阴性对照不加IL2上清，以10%BCS RPMI1640代替，各设3个平行孔。置37℃ 5%CO2培养箱内培养48 h，再向每孔中加入MTT（5 mg/ml）10 μl，继续培养4 h，吸弃100 μl上清液，加入酸化异丙醇100 μl（0.04 mol/L HCl异丙醇），充分振荡后静置20 min，以全自动酶标仪在560 nm波长处进行比色分析［2］ 。
       1.9  统计学处理采用方差分析，t值检验。
       　　2  结果
       2.1  红茶菌对小鼠NK细胞杀伤活性及体外巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表1。
       表1  红茶菌对小鼠NK细胞杀伤活性及体外巨噬细胞吞噬功能的影响（略）
       与对照组比较，*P＜0.01表1数据表明，用红茶菌液对小鼠进行灌胃后，能明显增强小鼠NK细胞对K562细胞的杀伤活性；增加小鼠巨噬细胞吞噬白色念珠菌的功能。
       2.2  红茶菌对小鼠IL1和IL2生物活性的影响结果见表2。 
       表2  红茶菌对小鼠IL1和IL2生物活性的影响（略）
       *与对照组比较，*P＜0.01从表2可以看出，胃内灌注红茶菌30 d后，小鼠IL1和IL2生物学活性得到显著提高。
       　　3  讨论
       红茶菌是一种由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌组成的天然微生态制剂，在我国及世界其他国家的民间广为栽培。红茶菌菌液中含有一部分茶叶的浸出物、活的微生物及其代谢产物，这些物质包括葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、醋酸、酒精、乳酸、氨基酸、蛋白质、叶酸、地衣酸、Vc和多种B族维生素等，还含有人体必需的钙、镁、钾、钠、磷等矿物质［3］。现有研究表明它具有较强的保健作用，包括：清理肠胃，预防和治疗便秘和痔疮；助消化；对高血压、高血脂、动脉硬化等心血管疾病和糖尿病具有一定的预防和治疗作用；预防各种结石的发生；利于机体排除毒素，防癌、抗癌以及增强机体免疫力等［4］。我们已进行的研究发现，长期胃内灌注红茶菌可以有效抑制肿瘤的形成与生长。为进一步探讨红茶菌的抑瘤机制，本研究对小鼠胃内灌注红茶菌后，对小鼠的一些免疫指标进行了测定，结果显示红茶菌可明显提高小鼠NK细胞杀伤活性，增强其腹腔巨噬细胞的吞噬功能，并能显著增强小鼠IL1和IL2的生物学活性。NK细胞可直接杀伤肿瘤细胞，并可通过合成和分泌TNF对肿瘤细胞起到杀伤作用，NK细胞杀伤活性的提高将增强机体的抗肿瘤能力。腹腔巨噬细胞可通过吞噬作用；借助抗肿瘤抗体的ADCC 作用；产生TNF及IL1等细胞因子而直接或间接杀伤肿瘤细胞。巨噬细胞也可通过产生某些酶及活性氧分子直接杀伤或抑制肿瘤细胞的生长。IL1能增强NK细胞的杀伤活性，促进胸腺细胞、T淋巴细胞的活化、增殖和分化，促进多种免疫分子的基因表达，从而增强机体的抑瘤作用。IL2可活化巨噬细胞，诱导CTL，NK和LAK等多种杀伤细胞的分化和效应功能，并能诱导杀伤细胞产生IFNγ，TNFα等细胞因子，IL2还可增强CTL穿孔素基因的表达，从而增强机体的非特异性抑瘤作用［5，6］。红茶菌的抑瘤机制及其对机体免疫功能的影响尚有待深入研究，但我们的初步研究发现红茶菌具有明显抑制肿瘤生长的作用，并可显著提高机体的免疫功能。红茶菌是一种易于培养的自然微生态饮品，在民间已有很长的流行历史，且实验小鼠长期饮用未见任何不良反应。作为一种保健制剂，红茶菌具有广阔的开发利用前景。
       　　参考文献：
       ［1］  苏东明,姜步义,张崇洁,等.腹腔巨噬细胞功能测定的改进［J］.上海免疫学杂志,1990，10（14）：212.
       ［2］  杨贵贞.免疫学生物工程纲要与技术［M］.长春：吉林科学技术出版社,1991：17.
       ［3］  苏秀萍. 红茶菌饮料制备技术［J］.实用技术, 2000，5（5）：10.
       ［4］  吴  薇,籍保平. 红茶菌国内外研究应用概况［J］.食品科技, 2003，12：9.
       ［5］  龙振洲. 医学免疫学［M］.北京：人民卫生出版社,1996：5.
       ［6］  熊碧芳,刘小红,戴水田,等.泰胃美针剂对烧伤病人细胞免疫的调节作用［J］.中国现代医学杂志, 1999,9(8)：24.
       (山东省滨州医学院  256603)