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       【关键词】  林氏咽宁散；,,金黄色葡萄球菌；,,抗菌实验
       摘要：目的探讨林氏咽宁散体外对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。方法以微生物试验琼脂平皿法、液体试管法观察其抗菌作用。结果对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用。琼脂平皿法最低抑菌浓度（MIC）为0.1 g/ml，液体试管法最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）均为0.025 g/ml。结论实验结果表明，林氏咽宁散体外抗菌活性测定显示，对金黄色葡萄球菌有一定的抗菌作用，与其相关的临床功能主治相符，为其临床应用提供了一定的实验基础。
       关键词：林氏咽宁散；  金黄色葡萄球菌；  抗菌实验
       林氏咽宁散系采用著名老中医祖传经验方，运用先进工艺制成的纯中药散剂。主要有凤凰衣、藏青果、薄荷叶、人工牛黄、珍珠粉、冰片、黄柏等10味中药组成。用于治疗急慢性咽炎等。本实验对林氏咽宁散进行体外抗金葡菌实验，为临床应用提供一定的实验基础。
       　　1  材料
       1.1  药品林氏咽宁散（常州市中西医结合医院，批号050829 ， 钴60辐射灭菌），青霉素－V钾片0.25 g（Sandoz GmbH,Kundl－Austria，批号133590），锡类散（江苏天士力制药有限公司，批号0502002）。
       1.2  菌种金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC(B)26003］(中国药品生物制品检定所)。
       1.3  培养基［1］
       1.3.1  Mueller－Hinton（M-H）肉汤培养基成分：牛肉浸膏3 g，纯水1 000 ml，可溶性淀粉1.5 g，酪蛋白水解物17.5 g。制法：将上述各成分混合，摇匀，调pH至7.4，分装，灭菌，备用。
       1.3.2  Mueller－Hinton琼脂（MHA）培养基成分：M-H肉汤1000 ml，琼脂17 g。制法：将琼脂加入M-H肉汤内，加热溶解，分装，灭菌，备用。
       　2  方法与结果
       2.1  最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的测定
       2.1.1  平皿二倍稀释法［1］采用琼脂稀释法，用Mueller－Hinton琼脂（MHA）培养基对林氏咽宁散进行定量抗金葡菌试验。
       2.1.1.1  药液稀释称取林氏咽宁散6 g，加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液30 ml振摇，混匀，即为0.2 g/ml供试液。取青霉素－V钾片1片，研磨，用pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液溶解并稀释至0.000 025 g/ml（相当于青霉素V 42.375 u/ml）的溶液，作为药物对照液。取锡类散3 g，加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液15 ml振摇，混匀，即为0.2 g/ml的对照液。取无菌空试管6支，第1管中放入林氏咽宁散供试液（0.2 g/ml），第2～6管中分别加5 ml pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，于第1管中取出5 ml放入第2管中，混匀，即为0.1 g/ml的供试液，同法从第2管取出5 ml放入第3管，如此连续稀释至第6管，供试溶液的含药浓度依次为：0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25 g/ml。取无菌空试管 6  支，同法将锡类散依次稀释成0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25 g/ml的溶液。
       2.1.1.2  含药平皿制备分别取上述供试液与对照液1 ml加入无菌平皿中，然后分别加入相同量的Mueller－Hinton琼脂（MHA）培养基15 ml，充分摇匀，开盖，在净化台上适当消除冷凝水，待培养基凝固。同一浓度的药液平行做2个平板。用吸管吸取0.1 ml金黄色葡萄球菌稀释液（金葡菌浓菌液用灭菌的0.9％氯化钠溶液10倍系列稀释至10-3，经测定活菌数为82 000 cfu/ml）于上述各平板上，用接种棒均匀涂抹于整个平板。同时设一份不含药物的Mueller－Hinton琼脂（MHA）培养基平板作为阳性菌生长对照；一份含药物但不含实验菌的空白对照；一份pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液与Mueller－Hinton琼脂（MHA）培养基混合的稀释剂对照。
2.1.1.3  培养、观察结果将制备好的平板置35℃培养18～24 h后，观察各平板是否有金葡菌生长，金葡菌不生长的最低药物浓度，即为金葡菌的最低抑菌浓度。结果见表1。
       表1  平皿法抑菌实验结果（略）
       ＋ 表示试验皿长菌；   － 表示试验皿未长菌
       结果证实，青霉素V钾对金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］高度敏感。林氏咽宁散对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，固体平皿法最低抑菌浓度为0.1 g/ml。而锡类散在此系列浓度下对金葡菌的抑菌作用不明显。
       2.1.2  液体试管法［1，2］采用液体培养基倍比稀释法，用Mueller－Hinton（M-H）肉汤培养基对林氏咽宁散进行定量抗金葡菌试验。
       2.1.2.1  药液稀释取无菌空试管 10 支，于 10 支试管中加入Mueller－Hinton（M-H）肉汤培养基各1 ml，第1管中加入林氏咽宁散供试液（0.2 g/ml）1 ml，混合后吸取1 ml加入第2管，同法稀释至第9管，从第9管中取出1 ml于一灭菌空试管中作为空白对照，不加金葡菌以便观察供试液是否被污染。则1～9管的药物浓度依次为0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 12，0.001 56，0.000 78，0.000 39 g/ml。第10管作为阳性生长对照管。另取一灭菌空试管，分别加入0.5 ml Mueller－Hinton（M-H）肉汤培养基和pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液作为稀释剂对照管。取无菌空试管 10 支，同法将锡类散依次稀释成0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 12，0.001 56，0.000 78，0.000 39 g/ml的溶液。从第9管中取出1ml于一灭菌空试管中作为空白对照，不加金葡菌以便观察供试液是否被污染。取上述青霉素－V钾0.000 025 g/ml（42.375 u/ml）溶液，作为药物对照液。
       2.1.2.2  加入菌液各试验管、阳性对照管加入0.1 ml金黄色葡萄球菌稀释液（金葡菌浓菌液用灭菌的0.9％氯化钠溶液10倍系列稀释至10-3，经测定活菌数为82 000 cfu/ml）。
       2.1.2.3  培养、观察结果将各试验管置35℃培养18～24 h后，取出，备用。将各试验管的培养物分别划线转种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，35℃培养18～24 h后，观察各平板是否有金葡菌生长，金葡菌不生长的最低药物浓度，即为金葡菌的最低抑菌浓度（MIC）。分别吸取各试验管的培养物0.1 ml，用接种棒均匀涂抹于整个甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，35℃培养18～24 h后，观察各平板上的金葡菌菌落数，平板上的菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。结果见表2。
       表2  液体试管法抑菌实验结果（略）
       ＋ 表示试验管长菌；  － 表示试验管未长菌
       结果证实，青霉素V钾对金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］高度敏感。林氏咽宁散对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，液体试管法最低抑菌浓度（MIC）为0.025 g/ml。最低杀菌浓度（MBC）为0.025 g/ml。而锡类散在此系列浓度下对金葡菌的抑菌作用不明显。
       3  结论
       林氏咽宁散体外抗金葡菌试验，平皿二倍稀释法最低抑菌浓度（MIC）为0.1 g/ml，液体试管法最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）均为0.025 g/ml。因为液体试管法药液与试验菌体充分接触，使得试验菌对药物较固体法更敏感一些，导致两法MIC值稍有一些差别，液体试管法的结果更精确。林氏咽宁散为纯中药制成的散剂，用于咽喉肿痛，抗菌消炎，喷于患处，治疗急慢性咽炎。从本实验可以看出，林氏咽宁散对金葡菌有一定的抑杀作用，且明显优于锡类散。
       　　参考文献：
       ［1］  马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册［M］.北京：科学出版社，2000：210，431.
       ［2］  中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南（药学;药理学;毒理学）［M］.134.
       (江苏省常州药品检验所  213002)