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       【关键词】  豚鼠；,,慢性气道变应性炎症；,,泡桐花总黄酮
       摘要：目的通过豚鼠哮喘模型研究泡桐花总黄酮抗哮喘气道变应性炎症的作用。 方法以卵蛋白（OA）致敏豚鼠为动物模型，灌胃途径予以泡桐花总黄酮大、小剂量，观察各组豚鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、嗜酸性粒细胞（EOS）数和嗜酸性粒细胞特异性趋化因子（Eotaxin）的改变。结果泡桐花总黄酮可显著延长致敏豚鼠的引喘潜伏期，不同程度地抑制BALF中的EOS和白细胞总数及气道上皮Eotaxin的过度表达。 结论泡桐花总黄酮对哮喘具有一定的保护作用，其中泡桐花总黄酮可能通过调控Eotaxin在气道黏膜上皮的过度表达，进而抑制Eos向哮喘气道的募集，消除气道炎症，成为其发挥抗过敏性哮喘的重要环节。
       关键词：豚鼠；  慢性气道变应性炎症；  泡桐花总黄酮
       Effect of Flavonoids in Fructus Paulowniae on Airway Allegic Inflammation in Guinea Pigs with Bronchial  Asthma
       CHEN Baohong, LI  Yingchao, ZHAO Yihong, FU Manhua
       (Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College, Luohe 462300,China; Pharmaceutical Institute of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052,China; The Traditional Chinese Medical Institute of Henan,  Zhengzhou 450052,China)
       Abstract：ObjectiveThis study was designed to investigate the effects of flavonoids in Fructus Paulowniae on IAR and LAR.MethodsAn guinea pig asthmatic model, induced by OVA was administered by intragastric gavage(ig) with different doses of flavonoids in Fructus Paulowniae. The latent period, the number of acidophils and the Eotaxin in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were observed. ResultsThe  flavonoids in Fructus Paulowniae could delay the latent period of airway inflammation significantly. The number of acidophils and total white blood cell in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was restrained by flavonoids in Fructus Paulowniae. In addition, the flavonoids in Fructus Paulowniae could inhibit the overexpression of Eotaxin in the trachea epithelium.ConclusionThe results suggest that flavonoids in Fructus Paulowniae can antagonize airway inflammation by inhibiting the overexpression of the Eotaxin in trachea epithelium.
       Key words：Paulounia fortunei(Semsl.)Hemsl;   Flavonoids;  Bronchia asthma
   
　　气道炎症是支气管哮喘(asthma)的病理基础，有多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与其炎症过程［1］。研究发现［2］嗜酸性粒细胞（EOS）趋化聚集，在气道炎症的形成过程中起重要作用，Eotaxin是EOS的选择性趋化剂［3］，也是EOS在哮喘发病过程中选择性增加的原因。因此，调控Eotaxin的过度表达，抑制EOS在气道内的募集，消除气道炎症，对治疗哮喘具有关键性意义。根据文献报道［4，5］，少常用草药泡桐花在支气管哮喘的临床治疗上具有一定的效果；泡桐花浸膏能够明显改善哮喘豚鼠肺组织的病理损伤，对哮喘豚鼠有显著的治疗作用；泡桐花主要成分［6］为挥发油、总黄酮、熊果酸等，其中总黄酮含量较丰富（3.081%）。我们以泡桐花总黄酮为研究对象，采用ig给药途径，结合图象分析技术探讨其抗哮喘作用及其机制。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物与分组健康白化豚鼠，雌雄各半，体重（200±50）g，由河南省实验动物中心提供。随机分为模型、阳性、空白对照组和泡桐花总黄酮大、小剂量组。10只/组。
       1.2  药品与试剂卵白蛋白（ovalbumin，OA）：Sigma公司，GradeⅢ；Eotaxin一抗(BA1469，Rabbit anti-Eotaxin)武汉博士德生物工程有限公司，相应二抗试剂盒及阳性对照片购自北京中山生物技术有限公司；醋酸地塞米松片，浙江仙琚制药股份有限公司，批号051247。泡桐花总黄酮由郑州大学药学院生药学研究室提供。
       1.3  动物诱喘及用药参照宫兆华［7］方法，常规饲养观察3 d无异常后，予10％OA生理盐水(N.S)溶液200 mg/kg ip致敏，并于当天开始按表1剂量给药。第15天时，予5%OA的N.S溶液雾化吸入诱导哮喘发作。用哮喘发作（动物取出后的表现为咳嗽、呼吸困难、烦躁、抽搐、跌倒甚至死亡)的动物进行实验。
       1.4  用药过程中哮喘防治作用观察用药第5，12天及第15天，3次对豚鼠进行激发实验。予5%OA的N.S溶液雾化吸入激发10 s，封闭时间共20 s，观察记录各组动物哮喘严重程度，取第15天的引喘潜伏期（自雾化开始至豚鼠腹肌痉挛、腹部凹陷出现的时间作为引喘潜伏期，超过6 min者以360 s计算）为统计指标。在第5，12天的激发过程中，先后有8只动物（大、小剂量组各2只，模型组3只，阳性组1只）因反应剧烈，抢救不及而窒息死亡。
       1.5  BALF（broncho alveolar lavag fluid BALF）的采集与细胞计数暴露豚鼠气管肺，用丝线结扎右肺门处，行气管插管灌洗左肺。灌入N.S 5 ml（抽吸2次）×2次，灌洗回收率大于80%，无菌离心（1 500 r/min×10 min），沉淀细胞以Hanks液处理后即刻在显微镜下计数细胞总数，细胞浓度调至2×106/ml，涂片，瑞氏染色，计数白细胞总数和EOS数。
       1.6  免疫组化Eotaxin检测摘取右肺中叶，放入乙醇、醋酸和甲醛混合固定液中固定48 h。石蜡切片（4 μm×3张）脱蜡至水，行免疫组化Eotaxin（EOS趋化性细胞因子）染色。免疫组化操作按说明书进行，DAB显色。另设不加一抗的切片作阴性对照。每只动物在细支气管黏膜各随机选择5个Hot视野，计算机图像分析系统检测每个Hot视野Eotaxin表达阳性信号的积分光密度IOD，以平均值表示该动物气道Eotaxin阳性表达水平。
       1.7  统计学处理所有数据以 ±s表示，使用SPSS11.0统计软件进行分析。
       　　2  结果
       2.1  泡桐花总黄酮对豚鼠引喘潜伏期的影响结果表明，各组造模动物的引喘潜伏期均较正常组缩短，表明造模动物皆发生了哮喘反应；各用药组与模型对照组比较具有显著性意义，P<0.05或0.01，说明各用药组对哮喘具有不同程度的保护作用。结果见表1。
       表1  泡桐花总黄酮对豚鼠引喘潜伏期的影响（略）
       与模型对照组比较，*P<0.05， **P<0.01
       2.2  对BALF中白细胞总数与EOS计数的影响结果表明，泡桐花总黄酮大剂量和阳性药对BALF中白细胞总数和EOS计数有抑制作用，与模型组比较，差异有极显著性意义（P<0.01）。结果见表2。
       表2  对BALF中白细胞总数与EOS计数的影响（略）
       与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
       2.3  豚鼠气道上皮表达Eotaxin阳性蛋白信号的图象分析镜下Eotmin阳性信号主要位于支气管黏膜上皮、肺泡上皮和平滑肌细胞、肺微血管内皮细胞胞浆，内含棕黄色颗粒物质。图象分析结果显示，模型组支气管黏膜上皮Eotaxin表达阳性信号的IOD显著高于空白组，差异有显著性意义（P均<0.01）；与模型组比较，阳性药和总黄酮大剂量组表达Eotmin阳性蛋白信号细胞的IOD明显降低，差异有显著性意义（P<0.05）。结果见表3。
　　
　　表3  对豚鼠气道Eotaxin 阳性细胞数量的影响 （略）
       与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01
       　　3  讨论
       哮喘(asthma)是一种由多种因素引起的以可逆性气道阻塞、气道高反应和气道炎症为特征的免疫变态反应性疾病［1，2］。慢性气道炎症是哮喘发病的一个重要因素，有多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与其炎症过程。气道炎症是气道高反应(Bronchial Hyperresponsiveness，BHR)的基础，无论过敏性还是非过敏性哮喘，气道炎症都以Eos的浸润募集和激活为最终途径，而哮喘时异常高表达于气道上皮的Eotaxin作为EOS高度选择性的化学趋化剂，成为EOS在哮喘发病过程中选择性增加的原因［2］。研究发现，浸润于哮喘模型动物细支气管黏膜的EOS数与该部位Eotaxin 阳性表达水平呈显著正相关［8］。因此，调控Eotaxin的过度表达，抑制Eos在气道内的募集，消除气道炎症，对治疗哮喘具有关键性意义。在哮喘的治疗药物中，甾体类抗炎药糖皮质激素等是目前较有效的药物，但因其副作用多，不宜长期使用，导致哮喘的控制率不尽人意，死亡率较高［1］。中药成分虽然复杂，但其具有整体调节且毒副作用相对较小的优点，因此，从中药中挖掘抗炎平喘成分是未来哮喘研究的重要内容。本实验以引喘潜伏期、EOS和Eotaxin作为观察指标，探讨泡桐花总黄酮抗支气管哮喘变应性炎症的防治作用及其可能的机制。实验结果显示，泡桐花总黄酮可显著延长致敏豚鼠的引喘潜伏期，不同程度地抑制BALF中的EOS和白细胞总数及气道上皮Eotaxin的过度表达，与模型组比较有显著差异。给药5 d和12 d，泡桐花总黄酮大小剂量不能预防再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘发作，并且动物死亡率高，这很可能是动物对抗原敏感度高所致。给药第15天，再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘发作较平稳，无死亡发生，可能与药效发挥和免疫耐受有关。 本实验结果表明，泡桐花总黄酮对哮喘具有一定的保护作用，其中泡桐花总黄酮可能通过调控Eotaxin在气道黏膜上皮的过度表达，进而抑制Eos向哮喘气道的募集，消除气道炎症，成为其发挥抗过敏性哮喘的重要环节。
       　　参考文献：
       ［1］  王国斌．重视哮喘，正确诊治和控制哮喘［J］.中原医刊，2002，29（11）：40．
       ［2］  Luis M．Teran CCL Chemokines and asthma［J］.Immunology today，2000，21(5)：235．
       ［3］  刘  新，张  苏，崔  毅．豚鼠气道炎症中Eotaxin基因表达的意义［J］.微生物学杂志，2005，25（3）：33.
       ［4］  全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1975：466.
       ［5］  张永辉，刘宗花，杜红丽，等．中药泡桐花浸膏对哮喘豚鼠肺组织作用的病理学研究［J］.新乡医学院学报，2002，19(6):473.
       ［6］  王  晓，程传格，刘建华.泡桐花精油化学成分分析［J］.林产化学与工业，2005，25（2）：99.
       ［7］  宫兆华，董竞成，倪  健．豚鼠支气管哮喘模型建立［J］.上海实验动物科学，2004，24(4)：204.
       ［8］  Park SW, Kim do J, Chang HS, et al． Association of interleukin-5 and eotaxin with acute exacerbation of asthma［J］.International Archives of Allergy & Immunology．2003，131(4)：283.
       (漯河市医学高等专科学校第二附属医院，河南 漯河  462300；郑州大学药学院，河南  郑州  450052； 河南省中医药研究院，河南 郑州  450052)