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       【关键词】  小柴胡汤；,,内异症；,,异位内膜细胞凋亡
       摘要：目的探讨小柴胡汤对内异症大鼠异位内膜细胞凋亡的影响。方法建立大鼠内异症模型，采用透射电镜技术及免疫组化方法，观察小柴胡汤对异位内膜细胞形态结构和Fas及Caspase-3蛋白表达的影响。结果中、高剂量小柴胡汤（10，15 g・kg-1・d-1）治疗后，异位内膜有较多腺上皮细胞出现凋亡的特征，表现为细胞体积变小，核固缩，胞浆和核染色质凝集，密度增高，细胞间凋亡小体，同时间质细胞中可见一些坏死细胞；异位内膜Fas蛋白、Caspase-3蛋白的表达水平明显高于其在位内膜。结论 小柴胡汤可通过上调Fas蛋白的表达，诱导异位内膜细胞的凋亡。
       关键词：小柴胡汤；  内异症；  异位内膜细胞凋亡
       The Study of XiaoChaiHu Decoction on Ectopic Endometrium Cell Apoptosis
       ZHENG Hui, ZUO Liandong
 
　　(Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the effect of XiaoChaiHu Decoction on ectopic endometrium cell apoptosis in rats. MethodsUsing the rat model, ectopic endometrium was evaluated by electron microscope. Fas and Caspase-3 protein expression in the endometrium and endometriotic tissue were observed by immunohistochemical method.ResultsThe glandular cell in the endometrial implant after therapy with middle or high-dose of (10，15 g・kg-1・d-1)  XiaoChaiHu Decoction showed characteristic features of apoptosis which displayed by the cell decreased in size, karyopyknosis , cytoplasmic and nuclear chromatin condensation , density increased and a lot of apoptotic bodies among cell. Whereas some stromal cell displayed degeneration and necrosis. The protein expression of Fas and Caspase-3 in endometriotic tissue of XiaoChaiHu Decoction group was higher than that in the endometrium.ConclusionThe therapeutic mechanism of XiaoChaiHu Decoction for endometriosis may be related to promoting the apoptosis in endometriotic tissue by increasing Fas protein expression.
       Key words：XiaoChaiHu Decoction;  Endometriosis；  Apoptosis
   
　　内异症病因复杂，目前无一种药物能达到根治效果。小柴胡汤是著名古方，由柴胡、黄芩、人参、半夏、炙甘草、生姜、大枣组成，具有免疫调节、抑制细胞增殖及诱导异常增殖细胞凋亡的作用［1］。我们曾在大体、光镜、电镜等形态学水平观察到，小柴胡汤可使内异症大鼠异位内膜明显萎缩，表明小柴胡汤对大鼠内异症具有治疗作用［2］。本研究观察小柴胡汤对内异症大鼠异位内膜细胞凋亡的影响，探讨小柴胡汤治疗内异症的作用机制。
       　　1  材料
       1.1   动物60只雌性SD大鼠，体重220～250 g，广东医学实验动物中心提供。
       1.2  药品与试剂 小柴胡汤，广州光华制药厂；丹那唑，江苏联环药业公司；Fas抗体，武汉博士德生物公司；Casepas-3抗体，NEWMARKER公司；链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒，北京中山生物技术公司。
       1.3  仪器JEOL-100CXII/T透射电子显微镜，日本电气公司；AO-820切片机，美国生物仪器公司；TIGER细胞图像分析仪，重庆大学泰格尔图像工程技术研究所。
       　　2  方法
       2.1  内异症大鼠模型的复制 参考Jones［3］方法建模。实验中60只大鼠共49只建模成功。
       2.2  分组与给药  分为5组，即小柴胡汤低、中、高剂量组、丹那唑组及对照组。小柴胡汤低、中、高剂量组分别给予5，10，15 g/kg小柴胡汤；丹那唑组给予0.1 g/kg丹那唑；对照组给予蒸馏水。各组大鼠注入药物溶液体积均为20 ml/kg，灌胃给药1次/d，连续4周。
       2.3  电镜观察给药4周后取材，标本经多聚甲醛-戊二醛固定液前固定2 h后，再经1%锇酸作后固定2 h，酒精、丙酮梯度脱水，Epon812渗透包埋，超薄切片机切片，铀铅双重染色，透射电镜观察。
       2.4  免疫组化法分析Fas及Caspase-3蛋白的表达按SP法染色。参照毛熙光等［4］方法，计算蛋白表达评分。
       2.5  统计学处理 使用SPSS10.0统计软件，对同一组大鼠在位内膜、异位内膜的综合评分结果进行两相关样本秩和检验，反映同一药物对在位内膜、异位内膜作用间的差异。
       　　3  结果
       3.1  小柴胡汤对异位内膜细胞形态结构的影响电镜下，小柴胡汤中、高剂量组和丹那唑组均可见腺上皮细胞和间质细胞的凋亡和坏死现象。小柴胡汤中、高剂量组以凋亡现象为多见，散在分布，表现为细胞收缩，细胞体积变小，核固缩、碎裂，胞浆凝集，染色质边集，胞膜和核膜完整，个别细胞间可见凋亡小体，同时也可见一些间质细胞的坏死。丹那唑组以坏死细胞居多，较集中呈点片状，主要存在于腺上皮，坏死细胞中的细胞器明显呈空泡状变性，间质细胞中可见一些凋亡早期细胞，表现为核膜完整，核周腔扩张，核质边集的现象。对照组中凋亡和坏死现象均较少发现。
       3.2  小柴胡汤对内异症大鼠异位内膜Fas,Caspase-3蛋白表达的影响Fas蛋白主要表达于各组在位、异位内膜的腺上皮细胞，大多在胞浆和胞膜表达，个别细胞呈全细胞表达；Caspase-3蛋白在各组在位、异位内膜的腺上皮细胞和基质细胞的胞浆中表达。结果见表1。
       表1  小柴胡汤对异位内膜Fas，Caspase-3蛋白表达水平的影响 （略）
       与在位内膜比较，*P＜0.05，△P＜0.01
       4  讨论
       本实验发现，小柴胡汤中、高剂量组异位内膜中有较多的腺上皮细胞凋亡，个别基质细胞坏死现象，丹那唑组中则以腺细胞坏死为主，细胞凋亡主要发生在间质细胞中。可见药物对不同细胞的影响并不单纯决定于药物本身的作用，可能还与不同细胞对药物所引起的局部内环境改变的反应和识别有关。丹那唑是17α乙炔睾丸酮的衍生物，它通过作用于下丘脑－垂体－卵巢轴的各个部位而抑制卵巢功能，引起在位与异位内膜萎缩。在间质细胞与腺细胞中，雌激素受体和孕激素受体表达水平不同，针对激素水平的变化所做出的反应也就不尽相同，小柴胡汤可能是通过改变微环境的免疫状态和功能，促进凋亡失调控，凋亡水平表现低下的细胞凋亡率增加［5］，使机体正常的免疫清除得以实现，达到预防和治疗的作用。正常子宫内膜，从增生期到分泌期，Fas mRNA及蛋白表达强度均呈明显上升趋势［6］，而Fas在内异症患者的在位及异位内膜中的表达均较低，使得在位及异位内膜始终保持一种低水平的凋亡状态，这种抗凋亡机制可能是子宫内膜细胞在子宫以外部位得以生长和增殖的病理生理学基础。小柴胡汤是著名古方，具有免疫调节和诱导凋亡的功能。研究表明，小柴胡汤可以上调一些恶性增殖细胞表面的Fas蛋白表达，从而促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。本研究的免疫组化结果显示，在小柴胡汤组内异症大鼠异位内膜腺上皮细胞Fas蛋白、Caspase-3蛋白的表达水平明显高于其在位内膜，而对照组检测结果却恰恰相反，丹那唑组中两者相差不明显。由此分析，小柴胡汤可能通过上调内异症大鼠异位内膜腺细胞表面Fas蛋白的表达，增强异位内膜细胞凋亡水平，而起到对异位内膜的抑制作用，提示小柴胡汤对内异症大鼠异位内膜的抑制作用可能是通过上调Fas蛋白的表达，而促进异位内膜细胞的凋亡。
       　　参考文献：
       ［1］  吴敏毓.医学免疫学，第3版［M］.合肥：中国科技大学出版社，1998：70.
       ［2］  左连东，郑  辉，李洪义，等. 小柴胡汤冲剂治疗子宫内膜异位症的实验研究［J］.中药新药与临床药理，2004，15（2）：86.
       ［3］  Jones R C. The effect of a luteinizing hormone releasing hormone(LRH) agonist， levonorgestrel， danazol and ovariectomy on experimental endometriosis in the rat［J］.Acta endocrinologica， 1984， 106(2)：282.
       ［4］  毛熙光，彭芝兰，郑  莹，等.FAS基因蛋白在人子宫内膜的表达及意义［J］.泸州医学院学报，1998， 21(5)：361.
       ［5］  Garcia-Velasco JA, Mulayim N, Kayisli UA, et al. Elevated soluble Fas-ligand levels may suggest a role for apoptosis in women with endometriosis［J］. Fertility and Sterility,2002, 78(4): 855.
       ［6］  Yamashita H， Otsuki Y， Matsumoto K，et al. Fas ligand， Fas antigen and Bcl-2 expression in human endometrium during the menstrual cycle［J］. Mol Hum Reprod，1999，5(4)：358.
       （暨南大学医学院，广东 广州  510632）