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       【关键词】  羊胎素；,,骨髓基质细胞；,,成骨细胞；,,增殖；,,分化
       摘要：目的探讨羊胎素对体外培养的SD大鼠骨髓基质细胞(Marrow Stroma Cells, MSCs)的影响。方法用MTT法检测MSCs的增殖；PNPP偶氮法检测MSCs碱性磷酸酶（ALP）的活性；细胞ALP染色观察成骨细胞的形成。结果在含羊胎素原液的0.625%，1.25%，2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠MSCs有明显的促进增殖的作用（P<0.01）;在含羊胎素原液的2.5%及5%+成骨诱导剂时， ALP的活性明显高于诱导剂对照组（P<0.05），而在含羊胎素原液的2.5%和5%浓度组， ALP的活性明显高于空白对照组及诱导剂对照组（P<0.001）；细胞ALP染色呈强阳性，加药组颜色明显深于对照组和诱导剂对照组。结论 羊胎素对体外培养的SD大鼠MSCs的增殖和向成骨细胞分化具有明显的促进作用。
       关键词：羊胎素；  骨髓基质细胞；  成骨细胞；  增殖；  分化
       Effects of Lamb Placentin on Marrow Stroma Cells Proliferation and Osteogenic Differentiation in vitro
       AI Chunmei,WEI Quande,WU Yi, CUI Liao
       (Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs, Zhanjiang 524023, China; Disease Control and Prevention Center  of Zhuhai 519000,China; Science and Technology Development Center, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of  placentin, the substance extract from lamb placenta, on SD rat"s marrow stroma cells ( MSCs) proliferation and osteogenic differentiation in vitro. MethodsProliferation of  MSCs mediated by lamb placentin was measured by MTT assay. The alkaline phosphatase (ALP) activity of MSCs was detected by PNPP assay.  Meanwhile, the cells osteogenic differentiation was examined by ALP staining.ResultsThe growth of MSCs was obviously accelerated by the lamb  placentin at the concentration  of  0.625%, 1.25%, 2.5%, 5% (P<0.01); the activity of ALP of  MSCs at the groups of 2.5% and 5% placentin containing osteoblast inducer was significantly higher than that of the blank group (P<0.05). However, the activity of ALP at the groups of 2.5% and 5% lamb Placentin without osteoblast inducer was significantly higher than the blank group and osteoblast inducer control group (P<0.001). The ALP staining cells at all placentin groups exhibited strong positive results. The colors of the cells at those groups were deeper than the inducer control group. ConclusionThe lamb placentin can remarkably increase the proliferation and induce the osteogenic differentiation of MSCs.
       Key words：Lamb placentin;  Marrow stroma cells;  Osteoblasts;  Proliferation;  Differentiation
   
　　羊胎素是利用现代生物技术从羊胎中提取的一种纯天然的生物活性物质，含有丰富的蛋白质，具有明显的抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及提高人体免疫能力的作用［1~3］。本实验利用蛋白酶水解提取之羊胎素作用于体外培养的SD大鼠MSCs，观察羊胎素对MSCs增殖及向成骨细胞分化的影响，为羊胎素作为预防和治疗骨质疏松症提供依据。
       　　1  器材
       1.1  试剂与仪器DMEM（H、L糖）培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，杭州四季清公司产品；胰蛋白酶、噻唑蓝、对硝基苯磷酸二钠、维生素C、地塞米松和β-甘油磷酸钠均为Sigma公司产品；Percoll液，Amersham pharmacia 公司产品；DMSO，江苏如皋富康试剂厂产品；其它试剂为广州化学试剂厂产品；CO2培养箱（美国NAPCO）；酶标仪（美国ELX800）；离心机（上海安亭仪器厂）。
       1.2  药物羊胎素（即羊胎水解液）由本院医药科技开发中心提供，取来自内蒙的健康羊胎，用现代工艺低温冷冻干燥制成。实验时取羊胎粉300 mg，在10倍量水中用蛋白酶水解8 h，除去杂质，灭菌，得澄清透明的羊胎水解液（总氮含量N=0.69%,pH值6.5）；实验时以原液为100%含量，用三蒸水稀释，实验终浓度为含原液的0.625%，1.25%，2.5%，5%和10% 5个浓度组。
       1.3  动物1月龄SD大鼠，雌雄各半。由本院动物中心提供(实验动物合格证：粤监证字2005A023号；发证机关：广东省实验动物监测所。动物实验环境设施监测合格证：粤监证字2005C055号；发证机关：广东省实验动物监测所)。
       　　2  方法
       2.1  细胞培养参照文献［4］，用Percoll液进行密度梯度离心的方法和传代贴壁筛选的方法相结合，分离培养大鼠MSCs。脱颈处死SD大鼠，用75%酒精浸泡5 min，在无菌条件下分离大鼠两侧股骨，去除软组织，切除股骨两端，每根股骨用5 ml DMEM(L)培养液从股骨上端往下冲出骨髓，将每根冲出的骨髓收集于同一烧杯中，充分吹散细胞，900 r/min离心10 min，弃上清液。沉淀用DMEM(L)培养液3 ml制成细胞悬液，将细胞悬液加到等体积的密度为1.073 g/ml的Percoll分离液上，900 r/min离心30 min后，收集界面层细胞，用DMEM(L)培养液洗涤离心2次，最后用含10%胎牛血清DMEM（L）培养液（含100 U/ml青霉素100 μg/ml链霉素）重悬，吹打均匀后以4×105/cm2密度接种到25 cm2培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱培养。7d后首次换液，去除悬浮细胞，以后每3天换液1次，细胞融合后用0.25%胰蛋白酶消化，传代。本实验用传至3~4代的MSCs进行实验。
       2.2  MSCs增殖率测定0.25%胰蛋白酶消化已融合成片的基质细胞，并吹打成单细胞悬液，以5×104个/ml接种于96孔塑料培养板，100 μl/孔，24 h后将培养液换成含5%胎牛血清的DMEM（L）培养基90 μl/孔，同时加入各浓度的羊胎素10   μl/孔，使其终浓度为0.625%，1.25%，2.5%，5%和10%，对照组加入等量的三蒸水，在加药后的第5 d加入MTT（用PBS溶解，5 mg/ml）20 μl，37℃孵育4 h，将培养液吸出，加入150 μl DMSO，待结晶完全溶解后，酶标仪测A值，检测波长为570 nm，参考波长630 nm。
       2.3  ALP活性测定0.25%胰蛋白酶消化已融合成片的基质细胞，并吹打成单细胞悬液，以5×104个/ml接种于96孔塑料培养板，100μl/孔，24 h以后换液。设空白对照组：10%胎牛血清DMEM（H）培养液90 μl/孔+三蒸水10 μl/孔；成骨诱导剂（10%胎牛血清DMEM（H）培养液含10-8mol/L地塞米松+50 μg/ml维生素C+10-8mol/L β-磷酸甘油）对照组：诱导剂90 μl/孔+三蒸水10μl/孔；羊胎素各浓度组：10%胎牛血清DMEM（H）培养液90 μl/孔+羊胎素10 μl/孔；诱导剂+羊胎素各浓度组：诱导剂90 μl/孔+羊胎素10 μl/孔，每组设8个平行孔，羊胎素的终浓度为含原液的0.625%，1.25%，2.5%，5%和10%。置37℃，5% CO2培养箱培养5 d，然后，将培养液吸出，用PBS 200 μl/孔洗2遍，加入PNPP孵育液（25 nmol/L二乙醇胺7.5 ml，1 nmol/L氯化镁0.75 ml，6.7 nmol/L PNPP 5 ml，三蒸水1.75 ml）150 μl，置37℃恒温箱避光孵育30 min，立即用酶标仪于405 nm波长测A值。
       2.4   ALP染色采用改良Comori钙钴法［2］来显示ALP。细胞以2×104/cm2接种于6孔塑料培养板，每孔2 ml，24 h后换液，设空白对照组、诱导剂对照组、5%羊胎素+诱导剂组、5%羊胎素组，每组设三个平行孔。每3天换液1次，至14 d，染色，拍照。
       2.5  统计学处理用SPSS 13.0软件对实验数据进行分析。实验结果以均差±s表示。组间比较采用方差检验。
       　　3  结果
       3.1  羊胎素对MSCs增殖的影响羊胎素作用MSCs 5 d后，0.625%~5%的浓度可显著提高细胞的增殖率。 与空白对照组比较P<0.01。 结果见表1。
       表1  MSCs增殖率A值测定结果（略）
       与对照组比较，*P<0.01，n=8
       3.2  对MSCs ALP活性的影响2.5%和5%的羊胎素+诱导剂作用MSCs 5 d后， ALP活性高于诱导剂对照组（P<0.05）；2.5%和5%的羊胎素直接作用MSCs 5 d后，ALP活性显著高于空白对照组（P<0.001），亦显著高于诱导剂对照组（P<0.001）。结果见表2。
       3.3  细胞ALP染色 从照片(图1)中可以看出，5%羊胎素组（4，5，6）和5%羊胎素+诱导剂组（7，8，9）经ALP染色后颜色明显深于空白对照组（1，2，3）和诱导剂对照组（10，11，12）。而ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。因此，羊胎素能促进 MSCs 向成骨细胞分化。
       表2  作用5 d ALP活性测定结果（略）
       与空白对照组比较,*P<0.001;与诱导剂对照组比较,△P<0.05,△△P<0.001；n=8
       图1  羊胎素对MSCs向成骨细胞分化的影响（略）
       　　4  讨论
       随着人类寿命的延长，社会的老龄化，骨质疏松症的发病率越来越高，严重影响了老年人的生活质量。因此，骨质疏松症的防治已成为全世界关注的课题。由于以往防治的药物有较多的副作用，长期应用病人不易耐受，所以寻找理想的防治骨质疏松症的药物一直是药理学研究的热点。近年来随着对干细胞研究的深入，对骨质疏松症的发病机制有了进一步的认识，认为MSCs中存在的间充质细胞的多向分化潜能与骨质疏松症的发生密切相关。MSCs是具有自我更新、复制及多向分化潜能的干细胞，不但是成骨细胞的来源，还在骨质疏松症发生时骨量减少中起重要的作用。MSCs成骨性分化能力下降是发生骨质疏松症的重要原因［5］。为此，设法保持甚至提高MSCs成骨性分化能力被视为一条有效的防治途径。所以目前以MSCs作为治疗靶点成为骨质疏松症防治的一个新方向。因此我们通过观察羊胎素能否促进MSCs向成骨细胞分化，从而判断其能否通过调节干细胞的分化方向来治疗骨质疏松，为骨质疏松的防治提供新的思路。羊胎素是利用现代生物技术从羊胎中提取的一种纯天然的生物活性物质，含有丰富的蛋白质，具有明显的抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及提高人体免疫能力的作用［1，3］；同时亦具有明显的促进成骨细胞增值、分化和钙化的作用［6］。本实验利用蛋白酶水解提取的羊胎素作用于体外培养的SD大鼠MSCs，在含原液的0.625%，1.25%，2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠MSCs有明显的促进增殖的作用;在含羊胎素原液的2.5％及5%+成骨诱导剂时，ALP的活性明显高于诱导剂对照组（P<0.05，见表2），在只含羊胎素原液的2.5%和5%时，ALP的活性亦明显高于空白对照组和诱导剂对照组；5%羊胎素和5%羊胎素+成骨诱导剂作用MSCs 14 d后，ALP染色呈强阳性，加药组颜色明显深于空白对照组和成骨诱导剂对照组。从实验中可以看出羊胎素既能促进MSCs的增殖，又能促进MSCs向成骨细胞分化，因为羊胎素显著提高MSCs ALP的表达，而ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。从实验中还可看出羊胎素促进MSCs的增殖和向成骨细胞分化的作用并不随浓度的增加而加强，而是在一定的范围（0.625%~5%）作用最强，因此推测其作用可能是通过受体作用机制发挥，羊胎素对MSCs的这种作用机理有待进一步研究。本实验通过体外细胞培养的方法，初步证实了羊胎素具有促进MSCs的增殖和向成骨细胞分化的作用。羊胎素的这种既能促进MSCs的增殖和向成骨细胞分化，又能促进成骨细胞增殖、分化和钙化的作用，且未见有毒、副作用的报道，在防治骨质疏松方面，应该具有较好的开发前景。
       　　参考文献：
       ［1］  杨秀芳，许牡丹，吴明鑫.活化羊胎素的提取与应用开发［J］.宝鸡文理学院学报（自然科学版），1999，19(1):40.
       ［2］  鄂  征.组织细胞培养［M］.北京：人民卫生出版社，1981:42.
       ［3］  刘少娟，陈冠敏， 何  聆. 羊胎素延缓衰老作用的研究［J］.环境与职业医学，2002，19(3):196.
       ［4］  Majumdar M, Thiede M, Mosca J, et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells［J］. J Cell Physiol,1998,176(1):57.
       ［5］  宋纯理,党更町.髓腔内脂肪细胞与骨质疏松［J］.中国骨质疏松杂志，2002，8(3):266.
       ［6］  艾春媚,崔  燎,魏泉德，等. 羊胎素对体外成骨细胞的增值、分化及矿化功能的影响［J］.中国骨质疏松杂志，2004，10(4):4956.
       (广东医学院天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江  524023；广东省珠海市疾病控制中心  519000； 广东医学院科技开发中心，广东 湛江  524023)