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       【关键词】  乙醇；,,肝细胞；,,原代培养；,,黄芩茎叶总黄酮；,,保护作用
       摘要：目的研究黄芩茎叶总黄酮（SSTF）对乙醇损伤小鼠原代培养肝细胞的保护作用。方法采用胰蛋白酶消化、分离小鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SSTF对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量，MTT法测肝细胞存活率。结果SSTF（100，200，300 mg・L-1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量的升高有明显的抑制作用。结论SSTF对乙醇损伤的小鼠肝细胞有明显的保护作用，其机制可能与SSTF的抗氧化作用有关。
       关键词：乙醇；  肝细胞；  原代培养；  黄芩茎叶总黄酮；  保护作用
       The Protective Effect of Total Flavonoid in  scutellaria baicalensis Stem-Leaf on Primary Cultured Mice Hepatocytes Injured by Ethanol 
       LI Suting, YANG Hemei, ZHOU Xiaohui
       (Chengde  Medical  College, Chengde 067000,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoid in Scutellaria baicalensis stem-leaf (SSTF) on primary mice  hepatocyes  injured by ethanol. MethodsPrimary  hepatocytes were isolated, cultured  by trypsin digestion and induced by ethanol. Various concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes  for 12h.The content of malondialdehyde(MDA) in hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods,the viabilities of hepatocytes were measured by MTT.ResultsThe elevation  of  MDA content of hepatocytes and ALT level in supermatant of cultural hepatocyes were restored remarkably by SSTF, hepatocytes viability was improved significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary mice  hepatocyes  injured by ethanol.This might be associated with its anti-lopoperoridation.
       Key words：Ethanol;  Hepatocytes;  Primary cultured;  SSTF;  Protective effect
   
　　肝脏是酒精代谢的主要脏器，过量饮酒可造成肝脏不同程度的损害，并进一步发展为脂肪肝、肝纤维化和肝硬化，严重危害人类健康。了解酒精性肝损伤的发病机制，筛选有效预防和治疗的药物应用于临床，是当前面临的重要课题。黄芩茎叶总黄酮(SSTF)是我院中药所对黄芩的茎叶部分提取的有效成分，整体实验已证实其对肝损伤有保护作用［1］。本文建立体外乙醇性肝细胞损伤模型，在细胞水平上进一步研究乙醇性肝损伤的机制及SSTF对肝细胞保护作用机制。
       　　1  材料与方法
       1.1  药品与试剂SSTF（含总黄酮73%）：承德医学院中药研究所提供，临用前以蒸馏水配制，用饱和碳酸氢钠调pH=7.6；Hanks液高压灭菌,4℃保存；0.8 g・L-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装,-30℃保存；基础培养液：RPMI 1 640培养基10.0 g,用超净水900 ml溶解,5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml,过滤除菌，临用前每80 ml,加入新生小牛血清20 ml,青霉素100 u・ml-1,链霉素100 μg・ml-1,胰岛素5 μg・ml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。
       1.2  动物昆明种小鼠，1~3 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。
       1.3  仪器CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。
       1.4  肝细胞分离培养［2］取新生小鼠30只，断头放血，无菌分离肝脏，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm3左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8 g・L-1胰蛋白酶10 ml,37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1000 r/min离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个・L-1，接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养。
       1.5  乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板培养24 h更换培养液，设正常对照组，25，50，75，100 mmol・L-1四个乙醇组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，TBA法检测MDA含量,MTT法测定肝细胞存活率。
       1.6  SSTF对诱导肝细胞损伤的作用取上述培养24 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SSTF(100，200，300 mg・L-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SSTF组加入乙醇100 mmol・L-1，同时SSTF组加入不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性和MDA含量，MTT法测定肝细胞的存活率。
       1.7  统计学处理数据以±s表示，用SPSS11.5计算机软件进行统计学分析, 组间比较采用t检验，P<0.05，有统计学意义。
       　　2  结果
       2.1  乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol・L-1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol・L-1乙醇作用最明显。
       表1  不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响（略）
       与空白对照组比较，#P＜0.05,##P＜0.01；n=6
       2.2  SSTF对乙醇损伤肝细胞的保护作用100 mmol・L-1乙醇作用肝细胞后，肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，细胞内ALT释放量明显升高，细胞内MDA含量较对照组明显增高；而给予SSTF保护后， ALT水平明显降低，MDA含量亦明显降低，肝细胞存活率明显升高，并呈现剂量依赖性(P＜0.05或P＜0.01)。显示：SSTF能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。
       表2  SSTF对乙醇损伤肝细胞ALT，MDA水平及细胞存活率的影响（略）
       与对照组比较，*P＜0.01,与模型组比较，#P＜0.05,##P＜0.01；n=6
       　　3  讨论
       乙醇本身和它的氧化物乙醛对肝细胞有直接毒性作用［3］。乙醇进入机体后，在肝细胞乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、细胞色素P450等作用下产生氧自由基，氧自由基除直接损伤肝细胞外，还可通过增加肝细胞对脂质过氧化的敏感性，导致细胞膜和细胞器破坏，肝酶逸出，细胞死亡［4］。ALT是肝细胞内主要酶之一，肝细胞膜损伤时，细胞内ALT释放量增加，因此检测培养液中ALT活性是判断肝细胞膜损伤最明显的标志［5］，MTT法检测细胞存活情况可直接反映细胞损伤程度，MDA是肝细胞脂质过氧化的最终产物，其含量高低可反映膜脂质过氧化程度的强弱和肝细胞损伤的程度［6］。我们在研究中发现，低剂量酒精对肝细胞损伤不明显，ALT水平和MDA含量变化不大，随着酒精浓度的增加，细胞培养液中ALT呈进行性升高，细胞存活率逐渐下降，并且MDA含量也呈现进行性增加，表明过量饮酒可引起肝细胞氧化损伤。为了充分证实SSTF对酒精性肝损伤的保护作用，我们以100 mmol・L-1乙醇制备小鼠肝细胞损伤模型。结果表明，在酒精损伤的肝细胞中加入SSTF后，肝细胞损伤明显减轻。随着SSTF剂量增加，培养液中ALT水平逐渐降低，肝细胞存活率明显升高，与模型组比较，差别显著（P<0.05或P<0.01），提示SSTF能增加肝细胞抗损伤能力，增加膜结构的稳定性，对酒精性肝损伤有明显保护作用。有研究表明，黄酮类化合物具有很强清除自由基和抑制脂质过氧化特性，并且许多黄酮类化合物的抗氧化作用明显大于维生素E［7］。SSTF是含有多个羟基的黄酮类化合物，在本研究中我们发现SSTF能明显降低酒精引起的肝细胞脂质过氧化反应产物MDA含量的升高，具有比较显著的抗氧化作用。表明SSTF之所以对酒精性肝损伤有明显保护作用，其机制可能是SSTF能有效对抗酒精引起脂质过氧化反应，保护肝细胞膜和细胞器结构和功能的完整性，使肝细胞免受酒精损伤。
       　　参考文献：
       ［1］  李素婷，杨鹤梅，石艳华，等.黄芩茎叶总黄酮保肝作用的实验研究［J］.中国中医药信息杂志，2004，11（7）：593.
       ［2］  丁  虹，彭仁，张卫国，等.对乙酰氨基酚对小鼠原代培养肝细胞损伤及阿魏酸钠的保护作用［J］.中国药学杂志，1997，32（4）：210.
       ［3］  Sergent O,Pereira M,Belhomme C,et al.Role for membrane fluidity in ethanol-inducde oxidative stress of rat hepatocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther,2005,1:5.
       ［4］  Hock J B,Pastorino J G.Ethanol,oxidative stress,and cytokine-induced liver cell injury［J］.Alcohol,2002,27(1):63.
       ［5］  刘烈刚，张  文，姚  平，等.酒精对人原代培养肝细胞的氧化损伤与CYP2E1关系的研究［J］.中国食品卫生杂志，2004，16（2）：104.
       ［6］  张  煜，黄  芸.银杏叶提取物预防心肌缺血再灌注损伤的研究进展［J］.国外医学・心血管疾病分册，2000,27（1）：29.
       ［7］  先  宏. 中药抗氧化性的主要成分及其自由基消除作用［J］.国外医学・中医中药分册，2003，25（3）：250.
       (承德医学院，河北 承德  067000)