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       【关键词】  银杏叶提取物；,,血红素氧合酶-1；,,再灌注损伤；,,凋亡
       摘要：目的探讨银杏叶提取物（EGb761）诱导血红素氧合酶-1（HO-1）表达抗缺血再灌注损伤（IRI）后心肌细胞凋亡的效果及其机理。方法48只兔随机均分为单纯IRI组、EGb761组、EGb761+ZnPPⅨ组，分别预先给予等容积的生理盐水，EGb761，EGb761+ZnPPⅨ腹腔内注入。24 h后，每组任选8只处死，检测心肌细胞内HO-1表达及活性，余兔结扎冠脉左前降支使心肌缺血40 min，再灌注4 h，取缺血心肌检测中性粒细胞浸润、丙二醛（MDA）含量、Bax蛋白与Bcl-2蛋白表达及心肌细胞凋亡指数（AI）。结果与单纯IRI组及EGb761+ZnPPⅨ组比较，EGb761组HO-1表达及活性均明显升高，中性粒细胞浸润及MDA含量明显降低，Bax 增加而Bcl-2降低，心肌细胞AI显著减少(均为P<0.01)。与单纯IRI组比较，EGb761+ZnPPⅨ组HO-1表达增加但活性降低(P<0.05)，MDA含量明显升高(P<0.05)，其余指标均无显著差异。结论EGb761能明显诱导心肌细胞内HO-1表达，并通过HO-1的抗炎、抗氧化等作用下调Bax表达，上调Bcl-2表达，从而显著抑制IR损伤后心肌细胞凋亡。
       关键词：银杏叶提取物；  血红素氧合酶-1；  再灌注损伤；  凋亡
       Study of Ginkgo biloba Extract Protect against Cardiomyocyte Apoptosis from Ischemia Reperfusion Injury by Inducing HO-1 Expression
       ZHANG Ying,HUANG Weiyi,CHEN Rong
 
　　(Department of Pathophysiology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China; Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000 ,China )
       Abstract：ObjectiveTo explore the protective effects and mechanism of heme oxygenase-1 (HO-1) expression induced by extract of Ginkgo biloba(EGb761) against cardiomyocyte apoptosis from ischemia reperfusion injury(IRI).Methods48 rabbits were randomly divided into simple IR group, EGb761 group and EGb761+ ZnPPⅨ group. Each rabbit in different groups was intraperitoneal injected with saline(5ml), EGb761(10mg/kg), EGb761(10mg/kg)+ ZnPPⅨ(7.5mg/kg) respectively. 24 hours later, 8 rabbits in each group were killed to measure myocardial HO-1 expression and HO-1 activity. Other rabbits were subjected for 40min of myocardial ischemia by ligation of left anterior descending coronary artery followed by 4h of reperfusion. The neutrophil infiltration, myocardial malonaldehyde(MDA) content, Bax and Bcl-2 protein expression, cardiomyocyte apoptosis index(AI) in ischemia areas were detected.ResultsCampared with simple IRI group and EGb761+ ZnPPⅨ group, the expression and activity of myocardial HO-1 increased significantly, the neutrophil infiltration and MDA content decreased. Bax expression increased and AI and Bcl-2 level decreased in EGb761 group(P<0.01 respectively). Compared with simple IRI group, EGb761+ ZnPPⅨ group showed higher myocardial HO-1 expression but lower HO-1 activity (P<0.01), while the MDA content increased (P<0.05),but the neutrophil infiltration, Bax and Bcl-2 expression and AI showed no significant difference.ConclusionEGb761 could induce HO-1 overexpression, through its antiinflammatory and antioxidative action to upregulate Bcl-2 and downregulate Bax, thus protect against cardiomyocyte apoptosis from IRI.
       Key words：Extract of Ginkgo biloba;  Heme oxygenase-1;  Reprfusion injury;  Apoptosis
   
　　银杏叶提取物(EGb761)被广泛用于缺血性心、脑血管病的防治并取得了良好效果。一般认为，EGb761抗缺血损伤的效果主要是源于其有效成分银杏黄酮直接清除自由基的作用和萜类内酯的抗血小板活化作用［1］。有研究揭示，银杏叶提取物中富含的银杏黄酮成分还能诱导体外培养的心肌细胞表达血红素氧合酶-1(HO-1)［2］。根据研究，采用基因转染的方法促使大鼠心肌细胞特异高表达HO-1能抑制缺血再灌注损伤(IRI)心肌细胞凋亡［3］。银杏叶提取物能否诱导在体心肌细胞高表达HO-1并据此抑制IRI后心肌细胞凋亡，迄今少见这方面的研究报道。我们拟对此进行实验研究并初步探讨其中的作用机制。
       　　1  材料与方法
       1.1  分组、动物模型制作及取材选用健康日本大耳白兔24只，体重2.1~2.4 kg，雌雄不拘，随机均分为单纯IRI组、EGb761组、EGb761+ZnPPⅨ3组，每组16只。各组兔预先分别给予相等容积（5 ml）的生理盐水、EGb761(10 mg/kg，贵州益佰制药股份有限公司产品)、EGb761(10 mg/kg)+ZnPPⅨ(7.5 mg/kg，Sigma公司产品)腹腔内缓慢注入，兔自由摄食和进水。24 h后，每组先任选8只活杀，取左室前壁心肌检测HO-1表达及活性，余兔经耳缘静脉注入3%戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，沿胸骨左缘切开，小心剪开心包，保持胸膜完整以使兔能维持自主呼吸，在距冠脉左前降支根部2~3 mm处穿线打活结，拉紧丝线使心肌缺血（心肌呈紫红色）40 min，随即松开丝线使心肌再灌注（心肌恢复红色）4 h，迅速处死兔并摘取心脏，剪下左心室，生理盐水漂洗后-80℃冻存待测各项指标。
       1.2  HO-1蛋白表达的免疫组化分析及HO-1活性测定取左室前壁心肌采用SABC免疫组化法（抗体购于武汉博士德公司）检测心肌细胞中HO-1的表达，显微镜下观察见细胞浆染成褐色者即为HO-1阳性表达细胞。用CD-8病理彩色图像分析系统，在200倍镜下随机选测5个视野的平均光密度值代表HO-1蛋白表达量。另取部分左室前壁心肌加入蔗糖-Tris缓冲液制备匀浆，差速离心法分离微粒体，考马亮兰法测定蛋白浓度，根据HO-1降解血红素生成胆红素的原理，参考何洁［4］的方法，以每毫克蛋白每小时催化生成胆红素的nmol数代表HO-1活性（nmol・mg-1・h-1）。
       1.3  中性粒细胞浸润检测参照Mullane［6］的方法，采用测定髓过氧化物酶(MPO) 活性的方法代表缺血区心肌中性粒细胞浸润量，以25℃下每分钟分解1 μmol过氧化物作为1u。
       1.4  丙二醛(MDA)含量测定取缺血区心肌采用硫代巴比妥法按试剂盒（购于南京建成生物研究所）说明书进行测定。
       1.5  Bax，Bcl-2蛋白表达的免疫组化分析取缺血区心肌常规石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，采用SP免疫组化法参照试剂盒（购自DAKO公司）说明书检测Bax，Bcl-2蛋白表达，检测Bax以AEC显色，胞浆中有红色颗粒者为Bax表达阳性细胞，检测Bcl-2以DAB显色，胞浆中有棕褐色颗粒者为Bcl-2表达阳性细胞。用CD-8病理彩色图像分析系统，在200倍镜下随机选测5个视野的平均光密度值代表Bax，Bcl-2蛋白表达量。
       1.6  心肌细胞凋亡指数(AI)检测取缺血区心肌常规石蜡包埋切片，脱蜡至水，使用TUNEL法凋亡检测试剂盒（购自Bochringer Mannheim公司）检测心肌细胞凋亡。光镜200倍下观察，核染成棕色者为凋亡细胞。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数200个细胞，以凋亡细胞数占心肌细胞总数的百分比作为心肌细胞AI。
       1.7  统计学分析实验所得数据均为计量资料，以 ±s表示，组间比较采用F+q检验。
       　　2  结果
       2.1  心肌细胞内HO-1表达量及HO-1活性比较免疫组化检测显示，单纯IRI组、EGb761+ZnPPⅨ组及EGb761组心肌细胞胞浆分别呈浅褐色、褐色及深褐色，3组间HO-1蛋白平均光密度值及HO-1活性均有明显差异。结果见表1。
       2.2  心肌中性粒细胞浸润及MDA含量比较EGb761组PMO活性及MDA含量均较其余两组显著降低，EGb761+ZnPPⅨ组MDA含量明显高于单纯IRI组，但PMO活性与单纯IRI组无明显差异。
       2.3  Bax，Bcl-2蛋白表达及心肌细胞AI比较单纯IRI组和EGb761+ZnPPⅨ组Bax表达阳性细胞较多，Bcl-2表达阳性细胞较少，有大量凋亡的心肌细胞（图1，图2）。EGb761组则是Bcl-2表达阳性细胞多而Bax表达阳性细胞及凋亡的心肌细胞均较少（图3），Bax，Bcl-2蛋白平均光密度值及心肌细胞AI在EGb761组与单纯IRI组和EGb761+ZnPPⅨ组比较均有显著差异，而在单纯IRI组与EGb761+ZnPPⅨ组之间比较则无明显差异。见表1。
       TUNEL标记法 ×200
       图1  单纯IRI组见较多胞核染成棕色的凋亡心肌细胞（略）
       TUNEL标记法 ×200
       图2  EGb761+ZnPPIX组见大量胞核染成棕色的凋亡心肌细胞（略）
       TUNEL标记法 ×200
       图3  EGb761组见少量胞核染成棕色的凋亡心肌细胞（略）
       表1  两组各项检测指标的比较（略）
       与单纯IRI组比较，*P<0.05， **P<0.01;与EGb761+ZnPPⅨ组比较，#P<0.05，##P<0.01
       　　3  讨论
       急性心肌IRI广泛存在于急性冠脉综合征、体外循环手术、心脏移植、心脏骤停与心肺复苏等过程中。业已证明，除严重缺血即刻引起心肌细胞坏死外，凋亡是早期轻度缺血，特别是再灌注过程中心肌细胞的主要死亡方式。已有研究显示，IRI致心肌内大量中性粒细胞浸润与活化，不断产生活性氧，包括H2O2，O2-，ONOO- 等，它们对心肌细胞造成直接氧化应激损伤的同时，还会诱导促凋亡基因表达，引起心肌细胞大量凋亡［7］。这种凋亡最早于IRI后1 h开始出现，数小时至数天达高峰，一直可延续至4周后。凋亡是导致IRI后心肌细胞进行性减少、左室重构与扩张的重要原因［8］。虽然近年临床上强调以急诊介入治疗等方式尽早开通闭塞冠脉以显著缩小心肌梗塞面积，但却不能有效抑制心肌细胞凋亡。可见，研究抗IRI后心肌细胞凋亡同限制急性期心肌梗死面积一样对改善远期心功能状态和预后意义重大。本文采用兔急性心肌IRI模型作研究，发现预先给予EGb761能明显诱导心肌细胞内HO-1蛋白表达及活性升高，在此基础上进行IRI实验，则心肌内中性粒细胞浸润、脂质过氧化产物MDA含量均明显降低，Bax蛋白表达减少而Bcl-2蛋白表达升高，心肌细胞凋亡指数则显著降低，EGb761+ZnPPⅨ组由于使用ZnPPⅨ特异性抑制了HO-1的表达及活性，结果EGb761的作用被完全消除，表现为心肌内中性粒细胞浸润，MDA含量、Bax及Bcl-2蛋白表达和心肌细胞AI均与单纯IRI组相近而与EGb761组差异显著，提示，本实验中提前24 h静注的EGb761并非直接起效而是主要通过诱导HO-1表达间接抗IRI的。已知HO-1作为起始酶和限速酶，催化血红素降解生成胆红素、CO和游离铁， HO-1与其酶解产物胆红素、CO共同组成细胞抗氧化应激损伤不可或缺的内源性保护系统［9］，而针对HO-1系统如何抗IRI后心肌细胞凋亡的研究则少有报道，鉴于Bax，Bcl-2是细胞凋亡最重要的一对正负调控因子，我们检测了EGb761诱导HO-1表达对Bax，Bcl-2的影响，发现HO-1高表达可显著降低Bax蛋白表达、升高Bcl-2蛋白表达，最终抑制IRI后心肌细胞凋亡，且这一作用可能主要是通过HO-1系统抑制中性粒细胞浸润、消除自由基引起的氧化应激损伤而实现的。除此之外，有研究报道，HO-1表达还可通过其酶解产物CO充当气体信号分子，直接抑制促凋亡蛋白Bax甚至P53蛋白表达，发挥抗细胞凋亡作用［10］。
       　　参考文献：
       ［1］  Kusmic C,Basta G,Lazzcrini G,et al.The effect of Ginkgo biloba in isolated ischemic/reperfused rat heart:a link between vitamin E preservation and prostaglandin biosynthesis［J］.J Cardiovasc Pharmacol.2004,44(3):356.
       ［2］  Chen JX,Zeng H,Chen X, et al. Induction of heme-oxygenase-1 by Ginkgo biloba  extract but not its terpenoids  partially mediated  its protective  effect against  lysophosphatidylcholine-induced damage［J］.Pharmacol Res，2001，43(1):63.
       ［3］  Vulapalli SR,Chen Z,Chua BH,et al.Cardioselective overexpression of HO-1 prevents I/R-induced cardiac dysfunction and apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2002,283(2):H688.
       ［4］  何  洁,张  敏,刘俊昌,等.血红素氧化酶-1在离体大鼠心肌缺血预处理中的作用［J］.中国病理生理杂志,2001,17(10):932.
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       ［7］  Palojoki E,Saraste A,Eriksson A,et al. Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 280(6):H2726- H2731.
       ［8］  Palojoki E,Saraste A,Eriksson A,et al. Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 280(6):H2726- H2731.
       ［9］  Takahashi T, Morita K, Akagi R, et,al. Heme oxygenase-1: a novel therapeutic target in oxidative tissue injuries.Curr Med Chem［J］. 2004, 11(12):1545.
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       (泸州医学院，四川 泸州  646000；  泸州医学院附属医院，四川 泸州  646000)