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       【关键词】  广西粉葛；,,葛根素；,,高效液相色谱法
       摘要：目的采用HPLC法测定广西粉葛中葛根素的含量。方法色谱柱Phenomenex Gemini C18柱（250 mm ×4.6 mm, 5 μm）；流动相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱；流速：1.0 ml/min；检测波长：250 nm；柱温：30℃。结果葛根素在800~2400 ng范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。回归方程为A=7.682×104C +5.885×104，r=0.999 3（n=5）。其平均回收率为99.49％，RSD为0.75％(n=5)。结论该方法简便易行，结果准确，可作为广西粉葛药材质量控制的有效方法。
       关键词：广西粉葛；  葛根素；  高效液相色谱法
       Determination of Puerarinin Content in Guangxi Radix puerariae thomsonii by HPLC
       YANG Lifang, LI Xiaoyan, LUO Weiqiang, PAN Hongping, DENG Guanghui, WEI Dongping
       (Guangxi University for Nationality，Nanning  530006, China； People’s Hospital of Guangxi Autonomous Region, Nanning 530021, China; Guangxi Medical University , Nanning 530021, China)
       Abstract：ObjectiveTo determine the content of puerarin from Guangxi Radix puerariae thomsonii by HPLC.Methods The isolation was conducted on a phenomenex gemini C18 column (250 rmm ×4.6 mm , 5 μm ), the mobile phase consisted of acetonitnle (A)-0.4% phosphoric and (B) in a gradient model, the flow rate wes 1.0 ml/min, the detection wavelength was 250 nm and the column temporature was 30℃.ResultsThe content of puerarin showed good linearity in the range of 800 ng~2400 ng，the regression equation was A=7.682×104C +5.885×104，r=0.999 3 (n=5), and the average recovery was 99.49％, RSD was 0.75% (n=5).ConclusionThis method is simple, rapid, accurate and reliable. It can be used for quality control of Guangxi Radix puerariae thomsonii.
       Key words：Radix puerariae thomsonii；  Puerarin；  HPLC
   
　　粉葛为豆科植物甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth)的干燥根。收载于《中国药典》各版［1］。主含异黄酮成分葛根素(Puerarin)、葛根素木糖苷(Puerarin―xyloside)、大豆黄酮（Daidzein）、大豆黄酮苷（Daidzein）及多量淀粉等［2］，具有解肌退热、生津、透疹、生阳止泻之功效［3］。葛根素是粉葛药材中的主要活性成分之一，具有扩张冠状动脉，降低血压，减少心肌耗氧量；抗心率失常；降血糖，降血脂；抗动脉硬化，改善微循环；抗肿瘤等多种药理作用［4］。为此，粉葛越来越受到人们的重视。本文采用适宜的提取方法，通过HPLC法对广西不同产地粉葛中葛根素进行含量测定，可较全面地评价广西粉葛药材质量，为广西粉葛药材的开发和应用提供了实验基础。
       　　1  仪器与试药
       美国PerkinElmer  Series 200液相色谱仪；紫外检测器；葛根素对照品(中国药品生物制品鉴定所 批号：110752-2004110)；乙腈为色谱纯；水为超纯水。其余试剂均为分析纯。实验所用粉葛药材（产地：广西）经广西南宁食品药品检验所鉴定。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱：Phenomenex  Gemini  C18柱（250 mm ×4.6 mm,5 μm）；检测波长：250 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl；理论板数按葛根素计算不低于5000。流动相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，流速：1.0 ml/min。采用梯度洗脱，程序：0~5 min A/B（0：100）；5~25 min A/B（11：89）；25~40 min A/B（17：83）；40~50 min A/B（35：65）；50~70 min A/B（78：22）。
       2.2  对照品溶液的制备精密称取20 mg葛根素对照品，用30％乙醇超声5 min使溶解，定容至50 ml容量瓶中摇匀，即得(每毫升中含葛根素400μg)。
       2.3  供试品溶液的制备取粉葛药材粉末约1.0 g（过2号筛），精密称定，精密加入30%乙醇溶液50 ml，称定重量,用超声清洗器进行超声提取1 h，再次称定重量, 用30%乙醇溶液补足减失的重量,然后减压过滤，取出滤液，用0.45 μm水系微孔滤膜过滤，得供试品溶液。
       2.4  系统适用性实验在“2．1”项色谱条件下，葛根素与相邻峰可达到基线分离，分离度大于4.0，理论塔板数以葛根素计算为5000，色谱图见图1。
       2.5  线性关系考查精密称取20 mg葛根素对照品，用30％乙醇溶解（需超声5 min），定容至50 ml容量瓶中制成贮备液。分别精确量取贮备液1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 ml定容至10 ml，制成葛根素含量为40.00，60.00，80.00，100.0，120.0μg・ml-1的标准溶液，各进样20 μl，记录峰面积积分值，以峰面积积分值A对浓度C进行回归，得A=7.682×104C+5.885×104，r=0.9993（n=5）。表明葛根素在800~2400 ng范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。
       2.6  精密度实验精密吸取“2．5”项下的对照品溶液(80.00 mg・L-1)20 μl，连续进样5次，测得色谱峰面积，计算RSD为0.47％(n=5)。
       2.7  稳定性实验取3号样品（批号：031030）,按“2．3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样20 μl,于0，2，5，17，24，42 h进样测定，测得色谱峰面积，计算RSD为1.59％(n=5)。结果表明,供试品溶液在42 h内稳定。
       图1  粉葛药材HPLC色谱图（略）
       2.8  重复性实验取同一批粉葛药材样品（批号：031030）5份，分别精密称定，按“2．3”项下方法配制供试品溶液，分别进样20 μl，测得色谱峰面积，计算葛根素的RSD为1.88％(n=5)。
       2.9  回收率实验取已知含量的同一批供试品(批号20051001) 5份，每份0.5 g，置50 ml容量瓶,精密称定,分别精密加入葛根素对照品溶液(葛根素：400 μg・ml-1) 5 ml，加入30%乙醇溶液适量，用超声清洗器进行超声提取1 h，放冷至室温，用30%乙醇溶液定容,然后减压过滤，取出滤液，用0.45 μm水系微孔滤膜过滤，得供试品溶液。按“2．1”项方法进行测定，计算回收率，结果平均回收率为 99.49％ ，RSD为0.75％(n=5)。见表l。
       表l  粉葛中葛根素的加样回收试验结果（略）
       2.10  样品测定分别对6个不同产地的广西粉葛样品按“2．3”项下方法进行提取，按“2．1”项方法进行含量测定，结果见表2。
       表2  葛根素含量测定结果（略）
       　3  讨论
       3.1  流动相的选择《中国药典》2005年版Ⅰ部，关于粉葛药材中葛根素的含量测定方法是以甲醇水(25∶75)为流动相，其葛根素的吸收峰与随后的小峰的分离度为1．2左右，本实验采用乙腈(A)0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脱可使葛根素与相邻组分得到更好的分离，葛根素保留时间适中。流动相中加入适量的磷酸溶液,可使色谱峰对称,不拖尾。
       3.2  检测波长的选择取葛根素适量，加30％ 乙醇制成对照品溶液，置紫外分光光度计记录其紫外吸收光谱，结果显示，葛根素在250 nm波长处有最大吸收，故选择250nm为测定波长。供试品与葛根素对照品在相应位置上有相似的吸收峰且分离度良好。
       3.3  样品提取条件的比较实验比较甲醇和乙醇两种提取溶剂，结果表明用30％ 乙醇做提取溶剂，提取较为完全且毒性较小。对超声处理时间进行了考察，结果表明超声处理时间60 min为佳。
       3.4  本法样品处理方法便捷，测定方法简单，测定结果准确可靠，实践结果表明，可用于广西粉葛的制备、制剂生产过程的质量控制。
       3.5  从样品的HPLC图谱显示，本方法各组分分离效果良好，故本方法也可用于粉葛中其它成分的含量测定分析，此工作有待今后进一步开展。
       参考文献：
       ［1］  国家药典委员会. 中国药典,Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2000：203.
       ［2］  江苏新医学院.中药大辞典（下册）［M］.上海科学技术出版社，1985：2307.
       ［3］  陈  斌，刘训红，蔡宝昌.葛根高效液相色谱指纹图谱的研究［J］.时珍国医国药， 2005，16（5）：384.
       ［4］  陈连璧，柴  强，赵爱萍，等．葛根素对犬脑血流的影响［J］.中国中药杂志，1995，20（9）：560.
       ［5］  韦正友，汤  泉，焦东桂，等．葛根素对常压密闭条件下小鼠的抗缺氧作用［J］.基层中药杂志，1997，11(4)：43.
       ［6］  黄兆铨，叶武，陈申杰，等．葛根素对高血压患者血浆内皮素和一氧化氮的影响［J］.中国现代应用药学杂志，1999，16 (3)：13.
       ［7］  王桂霞.葛根素在心血管病中的应用［J］.时珍国医国药，2005，16（6）：549.
       基金项目：广西壮族自治区教育厅科学基金资助项目（桂教科研［2004］20号）
　　
　　(广西民族大学，广西 南宁  530006；广西壮族自治区人民医院，广西 南宁  530021；广西医科大学，广西 南宁  530021)