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       【关键词】  莲心碱；,,脑缺血；,,C
       摘要：目的观察莲心碱对大鼠局灶性脑缺血CFos蛋白表达的影响并探讨其保护作用机制。方法采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，通过免疫组化法检测脑缺血24 h CFos蛋白的表达以及经莲心碱(3 mg/kg)处理后对该蛋白表达的影响。结果脑缺血24 h CFos蛋白的表达明显增加，莲心碱可显著抑制脑缺血后CFos蛋白表达。结论 莲心碱的神经保护机制可能与抑制CFos蛋白的表达有关。
       关键词：莲心碱；  脑缺血；  CFos蛋白
       Effect of Liensinine on CFos Protein Expression in Rats with Focal Cerebral Ischemia
       YU Wangui， CHENG Tingxuan， ZHANG Henwen，  XIE Ping, ZHANG Yangxiang， ZHANG Daoming，  LIU Lian,  DENG Deming
       (Medical School of Yangtze University , Jingzhou, Hubei 434000,China; First Hospltal of Jingzhou, Jingzhou, Hubei 434000, China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of liensinine on CFos protein expression in Rats with focal cerebral ischemia and investigate its protective mechanism. MethodsThe model of focal cerebral ischemia in rats was made by suture-occluded method, the expression of CFOS protein and the effect of Liensinine (3mg/kg) applied prior ischemia on the expression were detected by immunohistochemical method after cerebral ischemia 24 h. ResultsThe expression of CFOS protein significantly increased after 24 h ischemia and Liensinine significantly inhibited the expression of CFos.ConclusionThe protective mechanism of Liensinine is probably related to the inhibition of CFOS gene expression.
       Key words：Liensinine；  Cerebral ischemia；  CFos Protein
   
　　CFos 蛋白是凋亡相关基因C-Fos的表达产物，对缺血反应敏感,可作为研究脑缺血后药物干预的指标［1］。莲心碱是从中药莲子心中提取分离得到的双苄基异喹啉类化合物，具有降压、抗心律失常等心血管活性［2］，文献报道与莲心碱同属莲子心主成分的另一生物碱―异莲心碱对实验性脑缺血损伤具有保护作用［3］，同时我们在实验中观察到莲心碱对脑缺血具有保护作用，但其作用机制未明。本研究通过观察莲心碱对局灶性脑缺血CFos蛋白表达的影响，探讨其对大鼠局灶性缺血性保护作用的机制。
       　1  材料
       1.1   动物   雄性SD大鼠24只，体重200~240 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(动物中心许可证号为SYXK(鄂)20040028，动物合格证号为SCXK(鄂)20040007)。
       1.2  药物与试剂    莲心碱由武汉大学药学院药物化学研究室提供。免疫组化试剂，兔抗CFos抗体和生物素化羊抗兔IgG购自武汉博士德公司，抗体效价1∶100。
       1.3  仪器  切片机，LeicaDM LB2显微镜和LeicaMPS60显微照像系统(德国Leica 公司)。
       　2  方法
       2.1  动物模型制备与分组   24只雄性SD大鼠随机分为3组，分别为假手术组、缺血组、莲心碱组。参考Zea Longa等［4］的方法，并稍加改良制备大脑中动脉局灶缺血模型。3组大鼠分别予以戊巴比妥钠30 mg/kg，腹腔注射麻醉，颈部正中切口， 暴露右侧颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)，5/0丝线结扎颈外动脉，分离与颈总动脉伴行的迷走神经，在距颈总动脉分叉处近端0.5～0.6 cm处结扎颈总动脉，在结扎线的远端，置丝线备用， 用微小动脉夹夹闭备用线远端的颈总动脉，在备用线的近端用4号半头皮针扎一小孔，将作标记5/0尼龙线栓送入切口，向上推至动脉夹处，将备用线扎紧，随即松开动脉夹，缺血组和莲心碱组将线栓沿颈总动脉、颈内动脉顺行向上插入至MCA起始部，遇阻力时停止，从颈总动脉分叉处计算插入深度1.7～1.9 cm，造成大脑中动脉血供阻断。而假手术组将线栓沿颈总动脉、颈内动脉顺行向上插入，插入深度仅为1 cm，其余步骤同上。手术结束后莲心碱组舌静脉注射莲心碱3 mg・kg1，缺血组舌静脉注射同等剂量生理盐水，假手术组不给于处理。
       2.2  脑缺血体积的测量 24 h大鼠断头取脑，去除嗅球、小脑及低位脑干后，脑组织放于-20℃冰箱中，冷冻20 min，取出后间隔3 mm连续做冠状切片，置于1%TTC磷酸缓冲液中，37℃下恒温避光孵育30 min，正常组织染成红色，梗塞灶染成白色，脑片置4%多聚甲醛固定，数码相机拍照，多媒体彩色病理图像分析系统进行处理，计算出大鼠的梗死灶体积和体积百分比。
       2.3   CFos的免疫组化染色缺血24 h后以过量的戊巴比妥(50～100 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸左心室插管，灌注肝素盐水50 ml(100 u/ml)，迅速剪开右心耳继续灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液300 ml，30 min开颅取脑，去除小脑和脑干，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片。采用ABC法检测CFos蛋白，切片常规脱腊至水，灭活内源性酶，热抗原修复滴加1∶100稀释的兔抗C Fos抗体，4℃冰箱过夜；滴加生物素化羊抗兔IgG，滴加试剂SABC，DAB显色，苏木素轻度复染。
       2.4   CFos的检测在高倍视野下(10×40)，观察缺血区，胞核有棕色颗粒者为阳性细胞，选取5个高倍视野计数阳性细胞的百分率。阳性细胞百分率=阳性细胞/(阳性细胞数+阴性细胞数) ×100%。
       2.5  统计学方法实验数据以±s表示，两样本均数比较采用 t检验。
       3  结果
       3.1  脑缺血体积 经TTC染色后，缺血组大鼠脑梗塞体积百分比为（30.25±3.42）%，与假手术组比较,显著增高(P＜0.01)；莲心碱组脑梗死体积百分比为（20.98±1.52）%，与缺血组比较，显著降低(P＜0.01)。
       3.2  C Fos蛋白表达 与假手术组比较，缺血组大鼠脑组织C Fos蛋白阳性细胞数增多 (P＜0.01)；与缺血组比较，莲心碱组大鼠CFos蛋白阳性细胞数减少， (P＜0.01)。见表1及图1。
       表1  莲心碱对大鼠大脑皮质C Fos蛋白表达的影响 （略）
       *为每高倍视野细胞个数
       a假手术组       b缺血组         c莲心碱组
       图1  各组大鼠CFos蛋白的表达（×400）（略）
       　4  讨论
       缺血性脑血管疾病为临床常见的危重病，由于缺血导致的缺血性脑损伤是导致中枢神经系统功能受损的重要原因，因此脑缺血已成为当前防治脑血管疾病的热点之一，中西医学都对其进行了积极的研究，但尚缺乏疗效肯定的药物。缺血性脑损伤疗效的提高在很大程度上要依赖于其病理机制的研究，本文采用大鼠大脑中动脉(MCA)线栓法制成局灶性脑缺血再灌注动物模型，经TTC染色证实MCA分布区可见范围较恒定的梗塞灶，表明该模型制备方法简单、可靠，重复性好，适用于MCA缺血的病理机制研究实验。CFos为原癌基因，正常生理状态下，在神经细胞中仅呈极低水平表达，许多研究证实C－Fos的表达与脑缺血后神经细胞中信息的传递及其生存或死亡有密切关系。其作用机制是CFos蛋白与CJun等结合成异二聚体后，结合到靶基因激动蛋白－1(activator protein，AP1)或CRE位点，激活靶基因表达，从而启动神经元的内源性抗损伤或损伤机制［5］。本实验免疫组化和图像分析结果表明脑梗塞大鼠脑缺血区CFos蛋白明显表达，这可能是因脑组织缺血，CFos蛋白表达参与脑梗塞的病理过程。莲心碱是从中药莲子心中提取分离得到的双苄基异喹啉类化合物，具有降压、抗心律失常等心血管活性［2］。莲子心中含有主要生物碱有莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱等。文献报道与莲心碱同属莲子心主成分的另一生物碱―甲基莲心碱，具有减轻光化学诱导大鼠脑缺血的作用，其机制可能与对抗脑缺血时NO，Ca2+的病理性改变有关［6］，另有文献报道异莲心碱对实验性脑缺血损伤具有保护作用与其抗脂质过氧化，氧自由基生成和增强氧自由基的清除有关［3］，但有关莲心碱对脑缺血的保护作用未见报道。本实验观察到：脑缺血大鼠经莲心碱干预治疗后,脑缺血面积减少，且下调CFos蛋白表达。这提示莲心碱对脑梗塞神经元具有保护作用,其机制可能与抑制C－Fos蛋白表达有关。这为临床上莲心碱治疗脑梗塞提供了理论依据，至于莲心碱保护脑梗塞后神经元的详细机制有待进一步研究。
       　　参考文献：
       ［1］  王  华，韩玉昆，吴保敏.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤蛋白激酶C与cfos基因表达关系的探讨［J］.中国危重病急救医学，2002,14：621.
       ［2］  许  磊，姚崇舜，陈济明.莲心碱的研究概况［J］.中草药，2000，31（12）：955.
       ［3］  徐俊英，彭佳林，王嘉陵.异莲心碱对实验性脑缺血损伤的保护作用［J］.中国医院药学杂志，2005，25（11）：1026.
       ［4］  Longa EZ，Weistein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1)：84.
       ［5］  Hata R, Maeda K, Hermann D, et al. Dynamics of regional brain metabolism and gene expression after middle cerebral artery occlusion in mice［J］.Cereb Blood Flow Metab,2000,20(2)：306.
       ［6］  刘剑萍，唐伟军，吴  俊，等.甲基莲心碱对光化学诱导大鼠脑缺血损害的保护作用［J］.中国临床药学杂志，2002，11（5）：267.
       基金项目：湖北省卫生厅科研基金资助项目（No.JXzb74）
       (长江大学医学院，湖北 荆州  434000；湖北省荆州市第一人民医院  434000)