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       【关键词】  灵芝
       摘要：目的：测定富锗灵芝菌丝体氨基酸及超氧化物歧化酶(SOD)的含量，探讨培养基中GeO2的最适加量。方法：高效液相色谱仪分析氨基酸，氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD的含量。结果：培养基中添加400 mg・L-1的GeO2，灵芝菌丝体中氨基酸含量比对照提高54.34%，SOD提高16.73%。结论：为富锗灵芝菌丝体的应用奠定基础。
       关键词：灵芝；富锗；氨基酸；超氧化物歧化酶
       Determination of SOD and Amino Acids in Geenriched Mycelia of Ganoderma lucidum
       DANG Jianzhang, SUN Haiyan, XU Baiqiu, FENG Lixiong
       (Department of Applied Biological Engineering, Shenzhen Polytechnic College, Shenzhen，Guangdong 518055, China)
       Abstract:Objective:To determine the contents of SOD and amino acids in Geenriched mycelia of Ganoderma lucidum and explore the optimum dosage of GeO2 in culture medium.Methods:The contents of amino acids were analyzed by high performance liquid chromatography and SOD was determined by nitroblue tetrazolium photoreduction method.Results:Adding GeO2 400 mg・L-1 to the culture medium the contents of amino acids and SOD in Geenriched mycelia of Ganoderma lucidum increase by 54.34% and 16.73% respectively over normal mycelia of Ganoderma lucidum.Conclusion:It provides a firm foundation for application of Geenriched mycelia of Ganoderma lucidum.
       Key words:Ganoderma lucidum； Geenrichment; Amino acids; Superoxide dismutase (SOD)
             
　　灵芝（Ganoderma lucidum）是我国医药宝库中的一颗灿烂明珠，其有益心气、益肺气、坚筋骨、利关节、安神补肝等多种功用。天然灵芝含有机锗，可促进血液循环，对肿瘤、癌症有明显抑制和辅助治疗效果，并对糖尿病、高血压、胃炎、老年痴呆患者有治疗保健作用。因此以GeO2为锗剂，通过液体深层培养获得富锗灵芝菌丝体，并对其进行深入地研究，成为近年来比较活跃的领域［1～3］。本文利用不同浓度的GeO2作为添加剂培养灵芝菌丝体，然后检测富锗灵芝菌丝体的氨基酸组成和含量及SOD的活性，以探讨GeO2对灵芝菌丝体生长及代谢的影响，为富锗灵芝菌丝体作为营养和药用的补锗剂提供参考。
       　1  材料与仪器
       1.1 供试菌种 赤芝Ganoderma lucidum,AS. 565，由本院提供。
       1.2 斜面培养基（%）马铃薯（去皮）20；葡萄糖 2；KH2PO4 0.3；MgSO4・7H2O  0.15；琼脂 2；pH 自然。
       1.3 摇瓶种子和发酵培养基（%）马铃薯（去皮）20；葡萄糖2；麦麸2；蛋白胨0.5；pH自然。以上的培养基均经常规灭菌。
       1.4 药品标准品SOD（Sigma公司），其他化学试剂均为国产分析纯。
       1.5 仪器岛津UV-2401PC紫外分光光度计，安捷伦1100型高效液相色谱分析仪。
       　　2 方法
       2.1 摇瓶种子培养250 ml三角瓶装培养基80 ml，加4粒玻璃珠，常规灭菌，接种新鲜固体斜面菌一环（约0.5 cm2），28℃，120 r・min-1摇瓶培养至出现细小菌丝球。
       2.2 发酵培养500 ml三角瓶装培养基100 ml，分别添加0，20，40，80，200，400，800，1 000 mg・L-1的GeO2，代号为A，B，C，D，E，F，G，H，常规灭菌，然后各接入上述种子液10 ml，28℃，100 r・min-1，培养72 h。
       2.3 SOD酶液的制备发酵培养的菌丝体经100目筛网过滤，用0.85%NaCl溶液洗涤3次，布氏漏斗抽干，获得纯净菌丝体。称菌丝1 g，加3 ml 0.1 mol・L-1 TBE（Tris-H3BO4-EDTA）浸提液，冰浴下研磨成糊状，冷冻离心（10 000 r・min-1）10 min，取上清液（粗酶液）置冰箱内保存备用。
       2.4 菌丝干重测定将上述酶液制备中的菌丝体80℃烘干至恒重，称重。以每升培养基中含菌丝干重表示（g・L-1）。
       2.5 锗含量测定采用部分改进的分光光度法［4］。
       2.6 SOD检测方法参照文献［5］。基本步骤为取54 ml 14.5 mmol・L-1甲硫氨酸分别加入2.25 mmol・L-1氯化硝基四氮唑蓝（NBT），60 μmol・L-1核黄素、3 μmol・L-1 EDTA各2 ml，摇匀，总体积60 ml。取7支试管,各加入上述液3 ml，再分别加入粗酶液，0，3，6，9，12，15，18 μl，混合后放在透明试管架上，25℃，4000 lx 条件下光照10 min，取出试管，迅速测定A560 nm值，以不加酶液的照光管为对照。以抑制NBT光化还原50%为一个活性单位,并以标准品SOD检测的结果校正。以每克湿菌丝所含SOD活性单位数(U)表示（U・g-1）。
       2.7 氨基酸含量的测定准确称取上述菌丝样品细粉各100.0 mg，分别置水解管中,加6 mol・L-1 HCl 10 ml 封管，110℃水解24 h，开管后过滤，将滤液在60℃下减压蒸干，再用重蒸水洗后并蒸干,加0.1 mol・L-1 HCl定容到10 ml，上机（安捷伦1100型高效液相色谱仪）进样量为5 μl。
       3 实验结果与讨论
       3.1 锗标准曲线的测定准确吸取1 μg・ml-1的锗工作液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于50 ml容量瓶中，按样品分析方法测定A值分别为：0.00, 0.051, 0.118, 0.154, 0.229, 0.268。得出回归方程y=0.054 6x+0.000 2，R2=0.993 8，绘制成图。此法测量Ge的浓度范围在0.02~0.1 μg・ml-1内线性关系良好(图略)。
       3.2  GeO2添加量对灵芝菌丝干重、SOD、菌丝锗含量的影响在发酵培养基中添加不同浓度的GeO2，培养72 h，菌丝经处理后分别测定菌丝干重、SOD和菌丝锗含量。结果见表1。表1 不同浓度GeO2对灵芝菌丝干重、SOD和菌丝锗含量的影响（略）
       由表1可知，灵芝菌耐受GeO2的能力十分强，当GeO2加量为1 000 mg・L-1时,菌丝干重比对照（A）提高19.28%。随着培养基中GeO2量的增加，灵芝菌丝SOD的活力提高，其机理可能是GeO2可通过细胞的主动吸收而进入细胞内部，并与有机羧酸络合成锗盐，从而影响细胞某些酶类的活性变化［1］ 。但酶活力的提高与GeO2加量并不呈线性关系，原因可能是检测方法不够稳定，也可能是菌丝生长代谢的原因，有待进一步研究。
       3.3 富锗灵芝菌丝体氨基酸含量表2显示当培养基中添加400 mg・L-1 GeO2时,灵芝菌丝氨基酸的总量可达到208.08 g・kg-1dry wt,比对照氨基酸提高54.34%,必需氨基酸的总量达到74.27 g・kg-1 dry wt, 比对照提高68.57%。组氨酸对胃、十二指肠溃疡具有治疗作用，样品F组氨酸含量比对照提高44.26%；精氨酸具有抑制肿瘤的作用，天冬氨酸对肝病、心肌有保护作用，样品F比对照分别提高42.58%和 38.31%。从GeO2的成本、菌丝富锗量及氨基酸含量等综合考虑，笔者认为培养基中添加400 mg・L-1 GeO2较为合适。表2  富锗灵芝菌丝体氨基酸含量（略）
　　
　　参考文献：
       ［1］陈体强，翁启勇，李开本，等.灵芝菌丝体富锗效应研究初报［J］.福建省农科院学报,1994,9（3）：4649.
       ［2］牛建伟，谢平.灵芝多糖锗的抗肿瘤及免疫增强作用的研究［J］.中国生化药物杂志,2000,21(4):189191.
       ［3］牛君仿,王红庚,方正，等.富锗灵芝中锗的提取方法及其分布的研究［J］.河北农业大学学报,2002,25(4)：130133.
       ［4］袁瑾，李雯良，钟惠民，等.分光光度法测定虫草中的锗［J］.光谱实验室, 2000，（7）：447448.
       ［5］中国科学院上海植物生理研究所.现代植物生理学实验指南［M］.北京：科学出版社，1999：314315.
       基金项目：广东省深圳市自然科学基金资助项目(No.00107078)
       作者简介：党建章(1957)，男(汉族)，江西南昌人，现任深圳职业技术学院生物应用工程系副教授，学士学位，主要从事发酵工艺教学和科研工作.
       (深圳职业技术学院生物应用工程系，广东 深圳518055)
       收稿日期：20050412