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       【关键词】  金银花；,,绿原酸；,,多级逆流萃取
       摘要：目的对乙酸乙酯多级逆流萃取法从金银花粗粉中提取高纯绿原酸的工艺过程进行理论分析和实验验证。方法通过对相比n，萃取级数N，萃取液pH等对萃取效果影响的探讨,确定逆流萃取操作的最佳工艺参数。结果萃取液酸度在2.0左右，相比为1.5∶1，采用三级逆流萃取操作可得到纯度为83.46%(UV测定)的绿原酸产品,总绿原酸收率可达70.31%。结论采用醋酸乙酯多级逆流萃取可以由金银花粗粉制备高纯绿原酸。
       关键词：金银花；  绿原酸；  多级逆流萃取
       Study on the Multistage Countercurrent Extraction of  Chlorogenic Acid from Flos Lonicerae extract powder
       WANG Aiguo，YANG Haiyan, LIAO Xiaoyan,GUO Zhigang ,CHEN Fuming
 
　　(Department of Chemical Engineering,Tsinghua University, Beijing 100084, China; Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen 518057, China； Technology&Development Ltd. in Tsinghua Science Park, Zhuhai 519080, China)
       Abstract：ObjectiveThe multistage countercurrent extraction of chlorogenic acid(CGA) from Flos Lonicerae extract powder with ethyl acetate as the extractant was theoretically analyzed and experimentally proved. MethodsThe purity of the product and recovery rate of CGA was discussed by changing the number of stages, the ratio of phases and the acidity of solution to ascertain the optimal operation parameters of the process.ResultsThe results showed that the optimal condition was:  phase ratio=1.5:1, pH=2.0, the number of stages=3. At this condition, the purity of product obtained was as high as 83.46%(UV) with a recovery rate of 70.31%.ConclusionThe methad is available to obtain high purity chlorogenic acid from Flos Lonicerae extract powder.
       Key words：Flos Lonicerae;  Chlorogenic acid;  Multistage counter-current
   
　　绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是金银花中重要的生理活性物质，具有清热解毒、抗菌、抗病毒、升白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压血脂、清除自由基等作用［1］，此外还可作为天然食品抗氧化剂。目前以金银花为原料加工制成的市售产品除复方制剂外，多为浸膏或粗粉，这些产品均属于粗提物，其中绿原酸含量较低（20%～30%），因而产品的应用范围窄，附加值不高［2~4］。另一方面，市场上需要高纯度的绿原酸制品，但目前制备工艺还不是十分成熟，有待进一步开发和提高。胡润淮等［5］采用柱层析分离得到纯度75.9%的绿原酸产品，但该方法存在柱清洗麻烦和柱污染的缺点，工业化生产较为困难；马希汉等［6］采用铅沉法得到纯度大于90%的绿原酸产品，此法存在着重金属铅的污染问题。溶剂萃取法对绿原酸具有很好的提纯效果［7］，且该法容易实现工业化，是最值得期待的方法之一。本文以金银花粗提粉为原料，乙酸乙酯为萃取剂，研究金银花粗提物的逆流萃取工艺，通过实验探讨萃取相比n、萃取级数N、萃取的pH对萃取效果的影响,确定多级逆流萃取操作的最佳工艺参数，为实现绿原酸生产的连续化和规模化提供依据。
       1  材料与仪器
       金银花粗提粉（绿原酸含量15%左右，UV测定），购于安徽宣城百草植物工贸有限公司；绿原酸对照品（绿原酸含量95%，HPLC）购于美国sigma公司；乙酸乙酯(分析纯)。
       2  方法
       美国Agilent公司8453型紫外可见分光光度计。
       2.1  绿原酸含量的测定绿原酸质量分数的测定采用紫外分光光度法［8］。精密称取绿原酸对照品20 mg，置200 ml棕色容量瓶中，加50%甲醇定容，10℃以下保存，吸取绿原酸对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml于10 ml棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度线，摇匀。以50%甲醇为空白,紫外327 nm下测定吸光度。以绿原酸标品的浓度为横坐标,其相应吸光度为纵坐标，绘制绿原酸标准曲线见图1。得到回归方程：Y=0.036 96+0.053 66X，r=0.999 5。可见，在5～60 μg/ml的范围内，绿原酸浓度与其吸光度呈良好的线性关系。
       图1  CGA紫外标准曲线（略）
       2.2  流程模拟逆流萃取操作流程如图2所示。因为乙酸乙酯与水部分互溶,所以事先配好乙酸乙酯和水的两相平衡溶液，其中水相作为溶剂溶解原料，乙酸乙酯相作为萃取剂。萃取操作条件为:相比n=1∶1～2∶1，萃取时间5 min左右，萃取酸度1.0～3.0，萃取温度为室温。图2中每一个圆圈代表1次萃取操作。实验具体操作如下：
       2.2.1  取6个分液漏斗，分别编号1，2，3，4，5，6。向1号分液漏斗中，加入萃取液（原料液）和萃取剂（醋酸乙酯），摇匀，萃取5min后分相。萃取相为一级逆流萃取产品P1，萃余相移到2号分液漏斗中。
       图2  多级逆流模拟操作流程（略）
       2.2.2  向2号分液漏斗中加入新的萃取剂，萃取5min后分相。萃取相移到4号分液漏斗中，萃余相移到3号分液漏斗中。
       2.2.3  在3号和4号分液漏斗中分别加入新的萃取剂和萃取液进行萃取。3号分液漏斗分相后的萃取相移到5号分液漏斗中，萃余相为三级逆流萃取的萃余相E3。4号分液漏斗分相后的萃取相为二逆流萃取产品P2，萃余相移到5号分液漏斗中。
       2.2.4  5号分液漏斗萃取分相后的萃取相移到6号分液漏斗中，萃余相为二级逆流萃取的萃余相E2。在6号分液漏斗中加入新的萃取剂进行萃取，分相后萃取相为三级逆流萃取产品P3，萃余相为一级逆流萃取的萃余相E1。
       2.3  分配系数的测定由于萃取的总绿原酸是绿原酸和异绿原酸的混合物，两者在乙酸乙酯相中的溶解度存在差异，再加上实际的萃取体系中不仅含有绿原酸和异绿原酸，同时还存在其他杂质的干扰，因此分配系数需要实验来测定。因为不同的萃取条件都会影响分配系数，所以我们选择最佳萃取条件进行测定。分配系数m可以用下式来表示：    m=组分要萃取相中的浓度     组分在萃余相中的浓度
   
　　因此只要测定萃取相和萃余相中总绿原酸的浓度就可以得到分配系数m. 20℃时，绿原酸在水中的溶解度为0.59 g/100 ml，在乙酸乙酯中的溶解度为0.06 g/100 ml［8］。每次量取30ml原料液按图2所示的操作流程进行实验。萃取操作条件：pH＝2.0左右，相比＝1.5∶1，萃取时间为5 min左右。测定每一级的分配系数，3次平行实验结果见表1。
       表1  不同萃取级数对应的分配系数（略）
       以表1中数据，作出分配系数m与级数N的关系见图3。
       图3  分配系数m与级数N的关系（略）
       得出回归方程：y=1     α+bχ,其中a＝－0.828 89，b＝1.869 21，r＝0.998。
       2.4  逆流萃取过程的理论分析与计算多级逆流萃取与微分萃取、错流萃取比较,具有溶剂耗用量少,设备投资低,易于工业生产等优点［9］。其流程见图4。
       图4  醋酸乙酯多级逆流萃取CCA流程（略）
       图4中χf为萃取液中CGA的浓度,y0为新鲜醋酸乙酯中CGA的浓度,L为萃取液体积,V为萃取溶剂(醋酸乙酯)体积,y、χ分别为萃取相和萃余相中CGA的浓度。萃取液从左边第一级与萃取剂充分接触传质向右流动,至第N级流出为萃余相。乙酸乙酯从右边第N级流入,与萃取液逆向流动,到第一级流出成为萃取相。若假设每一级均达到萃取平衡,逐级进行物料恒算到第N级(最后一级),则有［9］:y1=y0+1     n［χf-χf+ny0(1+ε1+ε1ε2+…+ε1ε2…εN-1)     1+ε1+ε1ε2+…+ε1ε2…εN］=χfA+ny0B     n(1+A)(1)式中n=V     L--相比; εi=min--萃取因子;mi=yi     χi--分配系数;N--逆流萃取级数;A= 1+ε1+ε1ε2+…+ε1ε2…εN;  B=ε1ε2…εN多级逆流收率ρ为:    ρ=Vy1     Lχf=χfA+ny0B     χf(1+A)   (2)若所用新鲜醋酸乙酯相中不含CGA,取y0=0，则（1）、(2)式变为：  y1=χfA     n(1+A)   （3）  ρ=A     1+A=1-1     1+A    (4) 根据2.3中分配系数m与萃取级数N的关系式，取相比n＝1.5，按照(3)式计算最终萃取相的浓度y1以及(4)式计算收率ρ。结果见表2。
       表2  理论计算y1和ρ萃取级数（略）
       级数为4时，其A＝2.455；级数为5时，其A＝2.463。级数从4级增加到5级，其A值却增加0.008。由于萃取因子 随着级数的增大而减小，因此以后每增加一级的A值变化会更小。可见当级数大于5之后， A值的变化几乎可以忽略。若取A＝2.5，其收率ρ为71.43％。因此可以推断当级数大于5之后，在一定范围变化时，其收率ρ不会超过71.43％。
       3  结果
       3.1  结果按照图3所示的模拟逆流萃取流程，选择萃取相比n、萃取级数N和萃取pH值作为实验因素。实验指标选择CGA的收率和萃取产品总绿原酸的纯度。选用L9(34)正交实验表，实验因素水平和实验结果见表3。
       3.2  结果分析
       3.2.1  相比n对萃取效果的影响相比n对萃取结果的影响见图5。可看出，随着相比n由1∶1上升到2∶1, 总绿原酸的收率呈现上升的趋势，从58.3%增加到70.7%。这与一般的萃取规律是一致的。而总绿原酸的纯度在相比为1.5∶1时最大，相比大于1.5∶1时,总绿原酸的纯度反而下降。这可能是由于相比较高时会有更多的杂质被萃取到有机相中，导致最终产品总绿原酸纯度降低。另外,实验中发现相比为1∶1时,容易会出现乳化现象，分层困难。综合考虑总绿原酸收率和纯度，选择1.5∶1为最宜萃取相比。
       表3  CGA逆流萃取正交实验结果（略）
       图5  相比n对萃取效果的影响（略）
       3.2.2  萃取级数N对萃取效果的影响逆流萃取级数N对萃取效果的影响见图6。逆流萃取三级以后,总绿原酸的收率从56.99%增加到73.2%，增幅较大，表明萃取级数对总绿原酸收率的影响显著。但随着级数N的增加,总绿原酸的纯度呈下降趋势。从单级萃取到三级萃取,总绿原酸纯度从78.3%下降到75.3%,变化幅度不超过3%,表明萃取级数对总绿原酸纯度的影响不明显。这可能是由于随着萃取级数增加，使得萃取液中的杂质被萃入有机相的几率上升,造成产品中总绿原酸的纯度有所下降。另外,萃取级数增加也造成萃取操作时间的延长,由于绿原酸易被空气氧化，因此也会引起产品纯度的下降。兼顾到产品中绿原酸类的收率和纯度,宜采用三级逆流萃取。
       图6   萃取级数N对萃取效果的影响（略）
       3.2.3  pH对萃取效果的影响pH对萃取效果的影响见图7。可以看出，pH值在1.0～3.0范围内总绿原酸的收率变化不很明显。pH为2.0时，产品总绿原酸的纯度最高，达到84.4%。绿原酸是弱酸，在酸性条件下不电离，有利于在有机相中的溶解而提高萃取效果。据文献［10］报道，溶液的最佳pH值可根据组分的pKa值来确定，酸性组分提取的pH值一般应比其pKa值低1～2个pH单位。绿原酸的物理常数:pK1(羧酸)=3.59;pK2(第一酚)=8.59，因此酸性条件下有利于绿原酸的萃取。兼顾产品总绿原酸的纯度和收率,确定pH=2.0为最佳的萃取酸度。
       图7  pH对萃取效果的影响（略）
       3.2.4  最适萃取条件实验与验证确定相比为1.5:1，萃取级数为三级，pH为2.0为逆流萃取最佳操作参数。按照图2所示的操作流程，根据最佳操作条件，进行验证实验，得到产品的总绿原酸纯度为83.46%,总绿原酸收率为70.31%。同时测定的y1和收率ρ。结果见表4。
       表4  理论计算y1和ρ萃取级数（略）
       比较表2和表4数据,可以看出理论计算的结果和实验测定结果能够较好地吻合。
       4  结论
       4.1  以金银花粗提粉为原料，采用乙酸乙酯为萃取剂的逆流萃取法纯化绿原酸的过程中，相比n和萃取级数N对总CGA收率的影响显著，而pH值对总CGA纯度的影响显著。
       4.2  在保证较高总CGA收率和纯度的条件下,确定逆流萃取过程的最佳操作参数为：相比1.5:1,萃取级数三级,pH为2.0。在此条件下，可得到总绿原酸纯度大于80%的产品，收率不低于70%。本文的结果为下一步进行连续逆流萃取实验以及规模化生产高纯度绿原酸奠定了一定基础。
       　参考文献：
       ［1］  罗铭清.中草药有效成分理化与药理特性 ［M］.长沙：湖南科学技术出版社，1982：225.
       ［2］  刘军海，裘爱泳.绿原酸及其提取纯化和应用前景［J］.粮食与油脂，2003，（9） ：44.
       ［3］  许东颖，盛家荣，覃永周.金银花中绿原酸提取方法的比较和优化研究［J］.广西师范学院学报（自然科学版），2003，20（2）：20.
       ［4］  刘军海，裘爱泳.绿原酸的提取分离及含量测定［J］.中国油脂，2005，30（3）：54.
       ［5］  胡润淮，袁  珂，孙德梅.忍冬叶中绿原酸和总黄酮分离工艺的研究 ［J］.河南科学，1999，17（4）：383.
       ［6］  马希汉，张康健， 尉  芹，等.从杜仲叶中提取绿原酸纯品的研究［J］.西北林学院学报,1995,11(2):58.
       ［7］  杨海燕，孙海峰，汪爱国，等.乙酸乙酯萃取绿原酸过程研究［J］.时珍国医国药，2006，17（11）：2241.
       ［8］  沙世炎，徐礼，严敏如，等.中草药有效成分分析法（上册）［M］.北京：人民卫生出版社，1982：156.
       ［9］  李以圭，李  洲，费维扬.液液萃取过程和设备(上)［M］.北京:化学工业出版社,1989:96.
       ［10］  刘文英 .药物分析［M］.北京：人民出版社 ,1980:352.
       基金项目：珠海科技局资助项目（PB20041017）
       (清华大学，北京  100084；深圳清华大学研究院，广东 深圳  518057；珠海清华科技园技术发展有限公司，广东 珠海  519080)