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       【关键词】  骨质疏松症；,,大鼠；,,骨组织形态计量学；,,黄芪；,,司坦唑醇
        
        
       摘要：目的观察强骨宝复方制剂干预治疗去卵巢骨质疏松症模型大鼠胫骨钙、镁、磷及羟脯氨酸的含量和骨形态计量参数的变化，并讨论两者变化的相互关系。方法取32只Wistar雌性大鼠随机分为4组，按要求行去势手术，然后分别灌胃给药，8周后处死，取大鼠右胫骨烘干测定钙、镁、磷及羟脯氨酸；取左胫骨上段松质骨和中段皮质骨硬组织包埋、切片，图像分析松质骨、皮质骨形态计量参数。结果强骨宝可使去卵巢大鼠胫骨干重，羟脯氨酸、钙、镁与骨干重的比值等骨质量指标明显提高；去卵巢大鼠胫骨松质骨静态参数和动态参数显著增加，吸收参数显著降低；皮质骨静态及动态参数均无显著变化，内膜面骨吸收参数降低。结论强骨宝对去卵巢大鼠骨质疏松症的作用，从骨形态计量参数变化上看能促进骨形成，抑制骨吸收，增加松质骨的密度；从骨质量指标变化来看能促进骨羟脯氨酸等骨胶原有机质的分泌合成，并增加成骨细胞对钙、镁、磷等无机矿物质的吸收和沉积，从而促进新骨的形成，骨质量的增加。因此，骨形态计量参数与骨质量指标两者的变化是统一的。
       关键词：骨质疏松症；  大鼠；  骨组织形态计量学；  黄芪；  司坦唑醇
       The Comparatiue Effect of JGB on the Bone Histomorphometry and Bone Quality Parameter in Ovariectomized Rats
       WANG Yongdong，ZHOU Yamin，WU Tie，LIU Xiaoqing
       (Dongguan Technology Universitical，Dongguan 523808，China；Guangdong Medical College，Dongguan 523808，China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the changes of the compound of  Astragalus membranaceus and Stanozolol (JGB) on the bone histomorphometry and bone quality parameter such as Calcium,Magnesium,Phosphorus,hydroxyproline and bone weight in ovariectomized(OVX) osteoprosis rats, and analyse the mutuality between the changes.Methods32 Wistar female rats, randomly divided into 4 groups were shamly operated or ovariectomized ,then all were fed with medicine for two months and then killed.The right tibiae were roasted and weighed to be dissolved by muriatic acid for testing Calcium,Magnesium,Phosphorus, and hydroxyproline. The left proximal and middle tibias were trimed and processed undercalcified sections for cancellous and cortical bone histomorphometric analysis.ResultsThe bone quality parameter such as Calcium,Magnesium,Phosphorus,hydroxyproline and bone weight obviously increased, the static and dynamic parameters of the cancellous bone histomorphometry similarly significantly increased,but the resorption parameters decreased markedly; meantime,the static and dynamic parameters of the cortical bone histomorphometry both had no significant change, while the bone resorption parameter in the endocortical region decreased obviously.ConclusionThe cancellous bone density of OVX rats can be evidently improved by increasing bone formation and inhibiting the endocortical bone resorption.The bone quality also be markedly improved by enhancing hydroxyproline secretion and osteoblast resorption to Calcium, Magnesium and Phosphorus and leading to new bone reconstruction .Therefore, the changes of the bone histomorphometry and bone quality parameter in ovariectomized rats have the same consistency.
       Key words：Osteoporosis；  Rats；  Bone histomorphometry；  Astragalus membranaceus；  Stanozolol
   
　　骨质疏松症常表现为机体及骨组织生理性退行性变化，骨量减少，骨的结构改变和骨折危险度增加［1］。本实验强骨宝由中药黄芪和司坦唑醇组成复方，以去卵巢大鼠为骨质疏松症的动物模型，在强骨宝的作用下，观察大鼠胫骨骨形态计量学参数和钙、镁、磷、羟脯氨酸等骨质量指标的变化，并讨论其两者变化的相互关系。
       　1  材料与方法
       1.1  动物及分组3月龄Wistar普通级雌性大鼠32只（广东医学院实验动物中心提供），体重(268±22)g , 随机分为4组：正常对照组（Sham）、去卵巢对照组（OVX）、强骨宝组(JGB)、己烯雌酚组(DES)。除正常对照组外，其它3组均行去势手术。术后1 d，对照组、强骨宝组、己烯雌酚组分别以生理盐水、强骨宝（生药含量为2 g/ml）、己烯雌酚（0.5 mg/ml）按大鼠体重0.5 ml/100 g灌胃给药8周时间后处死。
       1.2  药品及试剂己烯雌酚，广东华南药业集团，批号050403；司坦唑醇，广西百会药业集团，批号050512；强骨宝，自制复方，主要成份为中药黄芪提取物及司坦唑醇。
       1.3  骨组织形态计量学测量及参数［2］全部大鼠在处死前第14，13天和第4，3天分别给其皮下注射盐酸四环素(25 mg・kg-1)和钙黄绿素 ( 5mg・kg-1)，以在骨表面形成黄色和绿色两层双荧光标记，动态观察两次注射期间骨形成的情况。大鼠给药8周后测定体重，处死解剖取左胫骨，胫骨上段按硬组织切片法进行不脱钙骨切片包埋、染色处理。所制切片在距骨骺线1 mm处至远端3 mm范围内进行松质骨形态计量学参数测量；胫骨中段皮质骨不脱钙骨磨片处理，按皮质骨骨形态计量学方法测量和参数计算．骨形态计量学静态参数包括：松质骨骨小梁面积百分率（%Tb.Ar），松质骨骨小梁分离度(Tb.Sp)，皮质骨组织面积百分数（%Ct.Ar）；吸收参数：单位骨小梁面积破骨细胞数量（Oc.N）；动态参数包括：松质骨骨小梁荧光标志周长百分率（%L.Pm ），松质骨骨小梁矿化沉积率(MAR)；皮质骨膜荧光标记周长百分数（P-%L.Pm）、皮质骨骨膜骨矿化沉积率（P-MAR）。
       1.4  骨矿质元素及羟脯氨酸（HOP）测定取右胫骨，除净附着骨上的肌肉和软组织，烘干至恒重，称量骨干重（BW），酸化骨并过滤取滤液分成两份：一份用ICP（电感偶合等离子体直读光谱仪）测定骨矿质元素钙（Ca）、镁（Mg）、磷（P）含量；一份用羟脯氨酸试剂盒测定样品中羟脯氨酸的含量，最后分别计算其与骨干重的比值。
       1.5  统计学处理所有数据用SPSS 9. 0统计软件，在WindowsXP环境下进行统计分析。结果以均数±ｓ表示，两组间比较采用独立样本的t检验。
       　2  结果
       2.1  强骨宝对去卵巢大鼠胫骨骨质量指标的影响大鼠胫骨干重（ＢＷ），羟脯氨酸（ＨOP）及钙(Ca)、镁(Mg)、磷(P)元素质量与骨干重的比值见表1。
       表1  实验大鼠胫骨干重与生化指标的变化（略）
       与OVX组比较，*P< 0.05,** P<0.01;与Sham组比较，△P< 0.05;△△ P<0.01
   
　　由表1结果可见，与Sham正常对照组比较，OVX组大鼠骨干重，羟脯氨酸、钙、镁、磷与骨干重的比值均明显降低，提示去卵巢后大鼠骨存在骨质量的丢失．与去卵巢模型组大鼠比较，使用JCB治疗后，大鼠骨干重，羟脯氨酸、钙、镁与骨干重的比值均明显提高，其结果与阳性药物DES治疗效果相似，说明经JCB药物治疗的去卵巢大鼠骨质丢失情况得到明显的改善。
       2.2  强骨宝对去卵巢大鼠胫骨骨形态计量学的影响
       2.2.1  强骨宝对去卵巢大鼠胫骨骨形态计量学静态和吸收参数的变化大鼠胫骨骨形态计量学静态和吸收参数的变化见表2。
       表2  实验大鼠胫骨骨形态计量学静态及吸收参数变化（略）
       与OVX组比较，*P< 0.05,**:P<0.01; 与Sham组比较，△P< 0.05， △△ P<0.01
       从表2结果可见，与OVX模型组比较，强骨宝（JGB）组静态参数除皮质骨面积百分数%Ct.Ar外均有显著性变化。经计算公式测值比较，其中强骨宝组%Tb.Ar增加47.7%， Tb.Sp降低32.40%；说明强骨宝组胫骨上段松质骨骨小梁面积、数量均有增加，骨小梁之间空隙减少，松质骨的密度增大；同时吸收参数Oc.N降低47.10%。由此可见，去卵巢大鼠服用强骨宝后破骨细胞数量减少而吸收功能也随之下降。
       2.2.2  强骨宝对去卵巢大鼠胫骨骨形态计量学动态参数的变化大鼠胫骨骨形态计量学动态参数的变化结果见表3。
       表3  实验大鼠胫骨骨形态计量学动态参数（略）
       与Sham组比较，△P< 0.05，△△ P<0.01
       由表3结果可见，与 Sham对照组比较，强骨宝组大鼠松质骨动态参数%L.Pm、 MAR均明显增加，差异具有显著性；而与OVX组比较，松质骨动态参数几乎没有明显差异，由于去卵巢模型属于高转换型骨质疏松症（骨形成及骨吸收均显著加快）［3］，由此说明强骨宝也具有促进骨形成的作用。
       　　3  讨论
       骨的形成是钙磷灰石等骨矿物质沉积在成骨细胞分泌的骨基质中的过程［4］。其中，钙、磷是骨矿物质的主要成份，羟脯氨酸是构成骨基质骨胶原的主要氨基酸，骨羟脯氨酸含量多少直接反映了骨胶原乃至骨基质合成的量。观察本实验结果骨干重以及骨HOP/BW，Ca/BW，Mg/BW，P/BW骨质量指标结果表明，强骨宝能增加去卵巢大鼠骨羟脯氨酸、钙、镁、磷等有机质和无机质的含量，导致骨干重增加。强骨宝干预去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨形态计量学参数中，静态参数（%Tb.Ar）及动态参数（%L.Pm、MAR）显著性增加，破骨细胞数量显著减少。这一结果表明强骨宝增强成骨细胞的活性，提高胫骨上段骨小梁部位新骨的矿化沉积率，促进新骨的合成；同时，破骨细胞数量显著减少，骨吸收降低，骨形成大于骨吸收活动，最终使骨小梁面积百分数增加，骨小梁数量增多，骨小梁分离度降低。因此松质骨的密度增加，骨量增加。骨质疏松症的细胞学机制表明［5］：成骨细胞与破骨细胞的偶联机制遭受破坏，成骨细胞及破骨细胞的活性均增强，但最终结果是破骨细胞的溶骨能力超过成骨细胞的骨形成能力，加速了羟磷灰石的溶解和有机质胶原蛋白的降解。通过比较观察强骨宝干预组大鼠骨质量指标数据以及骨形态计量学参数数据，可以发现两者之间的变化具有一定的规律性：骨形态计量学从微观上，从机理上反映了骨形成增加，骨吸收降低；骨质量指标从宏观上，从物质的量上反映了有机质羟脯氨酸及无机质钙、镁、磷含量和骨干重均是增加的；两者的这种变化是统一的。因此，强骨宝通过提高成骨细胞的活性，促进成骨细胞分泌合成骨羟脯氨酸等骨胶原有机质，增加成骨细胞对钙、镁、磷等无机矿物质的吸收和沉积，促进新骨的形成，骨质量的增加。
       参考文献：
       ［1］  刘忠厚，马述仕，刘成林，等.骨质疏松学［M］.北京：科学出版社，1998：142.
       ［2］  李青南，黄连芳，胡  彬，等.骨质疏松实验动物研究-骨组织形态计量学［M］.成都：四川大学出版社，2001：41.
       ［3］  Tanizawa T,Yamagu CT,Miyama Y. Reduction in bone formation and elevated bone resorption in ovariectomized rats with special reference to acute inflammation［J］. Bone,2000,Jan,26(1):43.
       ［4］  刘忠厚，马述仕,刘成林，等.骨质疏松学［M］.北京：科学出版社，1998：91.
       ［5］  Gideon A,Sevgi B,et al The cells of bone.Lawrence Riggs and L.Joseph Melton. Osteoporosis:Etiology,Diagnosis and Management［J］.1995：1.
       基金项目：广东省东莞市科技计划基金项目(ZC051213)
       (东莞理工学院，广东 东莞  523808；广东医学院药学院， 广东 东莞  523808 )