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       【关键词】  鼠曲草；,,黄酮类物质；,,微波辅助提取
       摘要：目的应用微波法提取鼠曲草中的黄酮类化合物。方法采用单因素实验正交实验,研究了乙醇体积分数、料液比、微波作用时间、微波功率对鼠曲草黄酮提取量的影响规律。结果微波提取法的最佳工艺条件为微波作用时间5 min，乙醇体积分数15%，料液比1∶60(g/ml），微波功率700W。在此参数组合条件下，黄酮提取率为4.72%。结论 与传统溶剂法的对比实验表明，微波法不仅节省时间，而且提取效率高，是一种快速、高效、节能的新型提取工艺。
       关键词：鼠曲草；  黄酮类物质；  微波辅助提取
       Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Chapha liumaffine D. Don
       WANG Shikuan， PAN Ming， GUO Chunxiao， LIU Lu
       (Department of Bioengineering , Sichuan Institute of Technology, Zigong  643000， China)
       Abstract：ObjectiveA novel extraction process of flavonoids from Chapha liumaffine D. Don by microwave-assisted extraction was tested.MethodsThe single experimental factor, such as microwave power, percent of ethanol volume, microwave treating time, ratio of solid to liquid was studied. Then, the optimum parameters were obtained by orthogonal test.ResultsThe optimum parameters were the ratio of solid to liquid 1∶60(g/ml), microwave treating 5 min, the microwave power ration 700W, percent of ethanol volume 15. The extraction rate of flavonoids was 4.72% at the optimum parameters.ConclusionCompared with the traditional soluent extraction, microwave-assisted extraction for chapha liumaffine D.Don flavonoids has the characteristics of shorter extract time and higher efficiecy and the cost is low.
       Key words：Chapha liumaffine D. Don；  Flavonoids；  Microwaveassisted extraction
   
　　鼠曲草Gnaphlium affine D.Don别名：佛耳草、清明菜，系菊花科鼠曲草属植物。本草原名“鼠耳”始载于《名医别录》《本草拾遗》称：“鼠曲草，生平岗熟地，高尺余，叶有白毛，黄花”，已收载于《中国药典》1977年版Ⅰ部中［1］。据测定，鼠曲草全草含5%黄酮苷，黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝作用，保护心脑血管系统和抗病毒以及杀虫等广泛的生理活性，且毒性较低，还可以用作食品、化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等［2，3］。 近年来，微波因促进反应的高效性和强选择性，及其操作简便，副产物少，产率高及产物易提纯等优点，已经被广泛应用于生化蛋白质水解和有机合成、酯化等反应。国外不少学者已将微波应用于天然产物的浸提过程。研究表明，微波技术应用与天然产物的提取具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高的特点［4，5］。本实验采用微波法提取鼠曲草黄酮类物质，以黄酮类物质的提取率为指标，研究了乙醇体积分数、料液比、微波作用时间、微波功率对黄酮类物质提取率的影响规律，并采用正交实验法确定了最佳提取条件。
       1  材料与方法
       1.1  材料与设备鼠曲草：采自四川理工学院汇南校区校园内；芦丁为生化试剂，购于北京化学试剂公司产品；其他试剂均为分析纯，购于成都科龙华工试剂厂KD23BDE型美的微波炉、TGL16B型Anke离心机、721E型Spectrum可见分光光度计、 GZXDH・300BSⅡ电热恒温干燥箱。
       1.2  方法
       1.2.1  索氏提取精确称取干燥的鼠曲草粉末样品(2.000 0±0.000 2）g放入索氏提取器中，在蒸馏瓶中加入200 ml 60%乙醇，水浴回流8 h。提取液转移至250 ml容量瓶中，用提取溶剂定容至250 ml，取样测定。
       1.2.2  鼠曲草中黄酮类化合物的微波辅助提取工艺流程：新鲜鼠曲草→预处理→按一定料液比加溶剂浸润→微波处理→抽滤→黄酮粗提液→定容→取样测定。操作要点：采摘新鲜鼠曲草，去掉根部及枯败部分，清洗沥干后，干燥，粉碎备用。准确称取一定量的鼠曲草粉末，加入一定量一定浓度的乙醇溶液作萃取剂进行微波处理，粗提液抽滤30 min，用60%乙醇定容至100 ml，取样测定。
       1.2.3  实验方案设计考察乙醇体积分数、料液比、时间、微波功率对鼠曲草黄酮类物质提取效果的影响。在单因素试验基础上，以微波功率，乙醇体积分数、提取时间、料液比为试验因素，选用L9 (34 )正交表进行正交试验，确定最佳提取工艺条件。
       1.3   分析方法
       1.3.1  标准溶液的配制与标准曲线的绘制［6，7］精密称取芦丁10 mg(120℃烘至恒重) ， 以80%的乙醇定容至5ml, 再加蒸馏水稀释至10 ml。得到浓度为1.0 mg/ml 芦丁标准液。准确吸取0, 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml芦丁溶液于10 ml具塞刻度试管中, 先加5% NaNO2 溶液0.3 ml, 摇匀放置6 min后,加入10% 的Al(NO3 )3 溶液0.3 ml，摇匀放置6 min，最后加1 mol /ml NaOH 溶液4.0 ml， 用60%乙醇定容至刻度, 摇匀后放置15 min， 在510 nm下测定吸光度， 参比为60%乙醇，得标准曲线(芦丁浓度y和吸光值A的关系)如图1所示，其回归方程：Y=0.076X+ 0.000 2，r =0.999 7。
       图1  标准曲线（略）
       1.3.2  鼠曲草总黄酮的测定及计算将定容后的粗体液以6 000 r/min离心18 min，提取液冷却，取上清液0.3 ml，按1.3.1的方法进行测定。按下式进行计算总黄酮提取率。总黄酮提取率（%）=m1/(m×V1/V2×1000) ×100%m1 =检测样品相当于标准芦丁的黄酮含量,mgm =样品质量,gV1 =检测样品稀释液体积，mlV2 =样品稀释液总体积，ml
       　2  结果与分析
       2.1  乙醇体积分数对鼠曲草总黄酮提取的影响在微波炉功率500 W，料液比1∶50( g/ml)，微波作用时间3 min的条件下，不同乙醇体积分数对鼠曲草总黄酮提取率的影响规律见图2。
       图2  乙醇体积分数对鼠曲草总黄酮提取的影响（略）
       由图2可以看出，在微波作用下，黄酮的提取率随乙醇体积分数的增加而提高。当乙醇体积分数增加到一定值时提取率反而降低，这是因为高体积分数的乙醇沸点较低，易挥发，部分黄酮也随着蒸气被带出。
       2.2  料液比对鼠曲草黄酮提取量的影响在微波炉功率500 W，乙醇体积分数10%，微波作用时间3 min的条件下，不同料液比对鼠曲草黄酮提取率的影响规律见图3。
       图3  料液比对鼠曲草黄酮提取的影响（略）
       由图3可知，黄酮提取率随溶剂量的增加先升高再降低，在料液比为l∶60(mg/ml)时，黄酮提取率出现峰值。这是由于微波辐射的能量使黄酮超微结构特性遭到破坏而溶于水中。料液比相对较小时，鼠曲草吸收的微波能量相对较多，细胞破碎的程度就比较好，溶解的黄酮就多；而溶剂体积过大时，吸收的能量相对减少，细胞破碎程度相对减小，因而黄酮溶解量也相应减少。
       2.3  作用时间对鼠曲草黄酮提取量的影响在微波功率500 W，乙醇体积分数10%，料液比为1∶50(g/ml)的条件下，不同微波作用时间对鼠曲草黄酮提取率的影响规律见图4。由图4可知，黄酮提取率随微波作用时间的延长先升高再降低，这可能是因为微波在短时间内对细胞膜的破碎作用就比较大，溶出物多，黄酮提取率也就高。随时间增加样品中黄酮类化合物可能会受到破坏，影响黄酮物质的浸出。
       图4  微波作用时间对鼠曲草黄酮提取量的影响（略）
       2.4   功率对鼠曲草黄酮提取量的影响在乙醇体积分数为10%，料液比为1∶50(g/ml)，微波作用时间为2 min的情况下，不同微波炉功率对鼠曲草黄酮提取率的影响规律见图5。
       图5  微波功率对鼠曲草黄酮提取量的影响（略）
 
　　由图5可知，随着微波功率的增大，总黄酮提取率先升高再降低，这可能是因为随着微波功率不断增加,分子运动加剧，细胞膜破碎程度加大，黄酮浸出率也随着升高；但细胞膜并不会无限制破碎，当微波炉功率太大时，微波对细胞内物质的选择性加热性能差异则减小，一些易溶于水的物质先被溶解，从而造成黄酮提取率的降低。
       2.5  优化工艺的正交实验为了优化提取工艺，根据单因素实验结果，将影响黄酮类物质提取效果的微波功率，乙醇体积分数、作用时间、料液比定为实验因素，每个因素3个水平，选择L9（34）正交表进行实验因素水平见表1，以总黄酮提取率为指标。结果见表2。
       表1  正交实验因素水平（略）
       极差越大，因素影响越大。
       由表2可知，影响提取效果的各因素主次顺序为：C＞A＞D＞B，即：作用时间>乙醇体积分数＞料液比＞微波功率。结果表明，提取工艺的最佳工艺条件为：A2B2C3D3，即：微波作用时间5 min，乙醇体积分数15%，料液比1∶60(g/ml)，微波功率70%W。由于最佳组合没有在正交实验中出现，因而进行3次验证实验。在此最佳参数组合条件下，黄酮提取率为4.72%，提取率大于试验表中的任一组合。
       2.6  微波提取法与索氏提取法提取率的比较按正交实验确定的最佳微波提取条件提取鼠曲草中的黄酮类化合物，并与索氏提取法进行提取率的比较(见表3)。表3 微波提取法与索氏提取法提高率的比较。结果见表3。
       表2  正交试验及结果（略）
       表3  微波提取法与索氏提取法提高率的比较（略）
       由表3可见，与索氏提取法相比，微波提取技术大大缩短了提取时间，而且提取率有所增加，可见，微波提取法节能、省时、高效。
       　3   结论
       微波提取技术用于鼠曲草总黄酮的提取是可行的，它具有省时、高效、节能等优点，提取效率优于索氏提取法，微波提取鼠曲草总黄酮的最佳工艺条件为：微波作用时间5min，乙醇体积分数15%，料液比1∶60(g/ml)，微波功率700 W。该工艺条件的研究为鼠曲草总黄酮提取的工业化生产建立了理论性基础，具有实际指导意义。
       　参考文献：
       ［1］  江苏新医学院.中药大辞典，下册［M］.上海：上海人民出版社,1979：2501.
       ［2］  王成章，陈  祥．银杏叶中黄酮类化合物及其分析方法［J］.林产化工通讯，1998，3：83.
       ［3］  张鞍灵，高锦明，王妹清．黄酮类化合物的分布及开发利用［J］.西北林学院学报，2000，15(1)：69.
       ［4］  Zhao E L，Gai Q Q，Zhang H R，Investigation of microwave assisted extraction of sea buckthorn flavonoids［J］.Food Ferment Ind(食品发酵与工业)，2004，30(12)：148.
       ［5］  Yue M E，Jiang T F，Shi Y P．Fast determination of flavonoids in Hippophae rhamnoides and its medicinal preparation by capillary zone electrophoresis using dimethyl-13-eyclodextrin as modifier［J］.Talanta，2004，62695.
       ［6］  邓桂春，王  鑫，赵丽艳，等.分光光度法测定银杏叶中黄酮的含量［J］.辽宁大学学报:自然科学版，2005，3：56.
       ［7］  贾彦峰．沙芥全草总黄酮提取方法及含量测定的研究［J］.陕西林业科技, 2004,2：1.

　　基金项目：四川省教育厅自然科学重点科研项目（No.2003A136）
       （四川理工学院，四川 自贡  643000）