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       【关键词】  牛膝
       摘要: 目的: 研究牛膝中甾酮的水煮提取工艺与含量测定方法。 方法: 采用正交实验，筛选牛膝中甾酮的最佳水煮提取条件;用高效液相色谱法对提取物中蜕皮甾酮的含量进行测定。 结果: 牛膝中甾酮的最佳水煮提取条件为共加入50倍量水，在80～100℃下提取2次，2h/次;以蜕皮甾酮对照品色谱峰面积y对其含量x进行回归统计，线性回归方程为:y=1.02751×106 X+158195，r=0.9996，线性范围为0.406～7.308μg。 结论: 水煮提取工艺得到牛膝提取物中蜕皮甾酮的含量为9.30%;高效液相色谱法适合于牛膝提取物中蜕皮甾酮含量的测定。
       关键词: 牛膝; 甾酮; 提取; 含量测定
   
　　Optimization of water extracting conditions of phytosterone from Achyranthes bidentata by orthogonal test
    
　　WANG Long ，XU X iu-ying； ZHENG Y i-min‘ FU S han-quan’ YI Z hong-hong
 
    （1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing400044，China;2.Chonging Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing400065，China）
   
　　Abstract: Objective:To study the water extracting process and content determination of phytosterone from A.bidentata.Methods:Screened the optimum extraction condition with the orthogonal test and determined the content of ecdysterone with HPLC.Results:The best extraction condition was as follows:adding50times amount of water and boiling on80～100℃for2times in all，2h each time.The ecdysterone linear range was0.406～7.308μg，r=0.9996.Conclusion:The content of ecdysterone in the extract is9.30%.HPLC method is suitable for the determination of ecdysterone.
       Key words: A.bidentata; Phytosterone; Extraction; Content determination
   
　　牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata BI.的干燥根，主产河南，具有补肝肾，强筋骨，活血通经的作用。甾酮是牛膝有效成分之一。牛膝中甾酮有蜕皮甾酮，牛膝甾酮，红苋甾酮等［1］ 。文献报道牛膝甾酮提取分离有乙醇回流 ［2～4］ 、甲醇回流［5］ 等方法，本文对牛膝中甾酮的水煮提取工艺和含量测定方法进行了研究，现报道如下。
       　　1 材料与仪器
    
　　供试药材购于重庆桐君阁医药公司，经重庆市中药研究院傅善权副主任技师鉴定，为怀牛膝A.bidentata的干燥根;蜕皮甾酮对照品（由本实验室自制，纯度为99.2%，批号030516）;大孔吸附树脂（天津制胶厂）;甲醇为分析纯;水为重蒸水;其它试剂均为分析纯;日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪。
       　　2 方法与结果
    
　　2.1 正交实验设计
       预试研究结果表明，采用水煮提取工艺，可取得较高的提取转移率，与用有机溶剂比较，具有成本低的特点。考虑到用水量、提取温度、提取次数和提取时间是水煮法提取牛膝中甾酮的重要影响因素，其中用水量对后续甾酮的分离提取过程影响较大，故作为重点考察因素，设置了6个水平，其它两个因素设置了2个水平。因此，选用L12 （6×22 ）不等水平正交试验表安排试验。表1 正交试验因素水平表（略）
    
　　称取牛膝药材适量，按上述正交实验条件进行处理，每组合重复3次。煮提液过滤后，滤液通过大孔吸附树脂柱，吸附完毕后，用85%乙醇溶液60ml洗脱，洗脱液于80℃烘干至恒重，得到牛膝提取物。
    
　　2.2 HPLC法测定蜕皮甾酮含量
       2.2.1 对照品溶液的制备
       精密称取干燥至恒重的蜕皮甾酮对照品，用体积分数60%甲醇溶解制成0.406mg/ml溶液，作为对照品溶液。
       2.2.2 样品溶液的制备 精密称取牛膝提取物适量，用60%甲醇制成5mg/ml的溶液，0.45μm滤膜滤过，滤液作为供试样品溶液。
       2.2.3 色谱条件
       参考文献［2～6］ 并经过筛选试验，确定最佳色谱条件为:迪马Phenomenex LUNA C18 柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相甲醇-水（50:50），流速0.8ml/min，检测波长243nm，柱温为室温。 t/mint/min
       2.2.4 标准曲线的制备和方法学考察
       精密吸取0.406mg/ml蜕皮甾酮对照品溶液。分别进样1，6，14，16，18μl，测定峰面积。以蜕皮甾酮对照品峰面积y对其含量x进行线性回归，得线性方程为:y=1.02751×106 x+158195，r=0.9996，蜕皮甾酮线性范围为0.406～7.308μg。经方法学考察，在16h内，样品稳定性RSD为2.17%，仪器精密度RSD为1.32%，样品重现性RSD为2.25%，平均回收率为99.5%，RSD为1.25%。
    
　　2.2.5 蜕皮甾酮含量的测定
       分别精密吸取样品溶液10μL，按上述色谱条件进样，测定峰面积。以标准曲线计算得到正交试验提取物中蜕皮甾酮的含量。表2 不同提取条件下蜕皮甾酮的含量测定结果（略）
       2.3 方差分析
       对表2中的甾酮含量这项指标进行方差分析，结果见表3。表 3试验结果方差分析（略）
   
　　3 讨论
       3.1  从直观分析的r值来看，影响提取物中蜕皮甾酮含量的因素主次顺序为A>B>C（A为水量，B为温度，C为时间和次数）。从方差分析结果来看，A、B两因素对提取物中蜕皮甾酮含量有显著影响，C因素影响不显著。综合分析，最佳工艺条件为A6 B2 C1 ，即共加入50倍量水，在80～100℃下提取2次，2h/次。在该工艺条件下，从100g牛膝中提取得到107.2mg蜕皮甾酮;采用甲醇回流提取工艺，100g牛膝中提取得到119.3mg蜕皮甾酮，两种方法提取率相近，表明水可以代替有机溶剂提取牛膝中的甾酮。
    
　　3.2  高效液相色谱法测定牛膝提取物中蜕皮甾酮的含量，方法简单易行，适合牛膝提取物的质量控制。
       　　参考文献:
    
　　［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1998:402-409.
        ［2］ 张翠英，梁生旺，张广强.不同产地牛膝中蜕皮甾酮的含量测定［J］.中国中药杂志，2001，36（10）:699-699.   
       ［3］ 国家药典委员会.中国药典.Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2000:54-54.
        ［4］ 孟大利，李 铣，熊印华，等.中药牛膝中化学成分的研究［J］.沈阳药科大学学报，2002，19（1）:27-27.
        ［5］ 陈 辛，黎万寿，朱久武，等.RP-HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量［J］.药物分析杂志，2000，20（4）:235-235.
        ［6］ 高晓燕，王大为，李发美.牛膝中脱皮甾酮的含量测定及促成骨样细胞增殖活性［J］.药学学报，2000，35（11）:868-868.
       作者简介: 王 龙（1980-），男（汉族），河南固始人，现在读重庆大学化学化工学院硕士研究生，主要从事中药、天然药物研究工作.
         　（1.重庆大学化学化工学院 400044; 2.重庆工学院生物工程学院 400050）
       收稿日期: 2004-12-23