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       摘要：目的研究草叶中总黄酮的提取工艺条件。方法采用正交实验法，以总黄酮含量为考察指标，对草的总黄酮提取条件进行优选。结果所考察的因素中，草的提取工艺各因数影响程度为：乙醇浓度>溶剂用量>提取时间；最佳水平搭配为：A2B2C1。结论 草中黄酮类成分提取的最适宜工艺为：75%乙醇，料液比 1∶15，回流提取2次，1 h/次。
       关键词：草；  总黄酮；  正交设计
       Study on Extraction Technology for Flavonoids in Humulus  scandens (Lour) Merr. by Orthogonal Design
       CHEN Weiguang， SHENG Jing， LIN Xia， TU Jiehong， SUI Fengying, YIN Xiu
       （Medical School of Jiaxing University, Jiaxing, Zhejiang, 314001, China; Medical College, Zhejiang Uaiversity, Hangzhou 310006, China）
       Abstract：ObjectiveTo ascertain extraction technology condition for flavonoids from Humulus  scandens (Lour.) Merr.MethodsThe optimizing extraction condition on the basis of flavonoids were determined by orthogonal design. ResultsThe order of factors which affected the flavonoid extraction was ethanol concentration > solvent quantity ＞ extraction hours；the best level match was: A2B2C1.ConclusionThe optimum extraction conditions are 75% ethanol extracting with material and solvent ratio 1∶15 for 1 hour in water bath for 2 times.
       Key words：Humulus  scandens (Lour.) Merr.；  Total flavonoids；  Orthogonal design
   
　　草为桑科植物Humulus  scandens (Lour.) Merr.的全草。具清热解毒、利尿消肿等功效，用于肺结核潮热、胃肠炎、痢疾、淋证、痔疮等证。据报道草全草含青兰苷、天门冬素、挥发油、鞣质及树脂；草叶含木犀草素葡萄糖苷、大波斯菊苷、牡荆素等黄酮类成分［1］。我们在研究草提取物的抗菌作用时发现，其水提取液对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性，并证实抗菌作用与草中所含的黄酮类成分有关。本研究通过正交实验法考查了乙醇浓度、溶剂用量、提取时间三因素对草叶中总黄酮提取率的影响，以确定其最佳提取条件，为合理开发草资源提供科学依据。
       1  仪器与材料
       岛津UV2401PC紫外分光光度计，SWB 5200型超声清洗机（上海必能信超声有限公司），电子天平（北京赛多利斯），芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号0080 9705），其他试剂均为分析纯。草采自嘉兴郊区，由本学院生药、天然药物化学教研室陈伟光老师鉴定。
       2  方法与结果
       2.1  标准曲线制备精密称取干燥至恒重的无水芦丁20 mg，置100 ml的容量瓶中，加60%的乙醇至刻度，摇匀，即得0.20 mg/ml对照品溶液。精密吸取该对照品溶液2，4，6，8，10 ml，分别置25 ml的容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加10.0%的硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加4%的氢氧化钠溶液10.0 ml，用60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，静置10 min后于512 nm处测吸光度［2］。以浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标进行线性回归，得回归方程为：A = 0.011 4 C + 0.025 7，r =0.999 7。线性范围： 0.4～2.0 mg/ml。
       2.2  样品提取与测定分别称取草叶粉末3.000 g， 以表1因素水平，按L9(34)正交实验表选择的条件回流提取2次，过滤，合并提取液，回收乙醇，水浴蒸干，70℃干燥3 h，干燥器中冷却后称重，浸膏得率(%)=浸膏重/样品重×100%。结果见表2。
       表1  因素水平（略）
       2.3  浸膏中总黄酮的测定取草浸膏，加60%乙醇，超声助溶，定容于50 ml的容量瓶中，3 000 r/min离心15 min，精密吸取上清液1.00 ml，按标准曲线制备项下处理测定黄酮含量。结果见表3。
       2.4  正交实验设计及结果 直观分析，由表2可见，乙醇浓度(A)对总黄酮提取影响最大，溶剂用量(B)次之，提取时间(C)影响最小，几无影响。最优水平组合为A2B3C3即溶剂为75%乙醇、20倍量溶剂、回流提取2 h/次。方差分析结果见表4。由表4可见乙醇浓度对总黄酮提取有显著影响，而溶剂用量、提取时间无显著影响。
       表2  浸膏得率与浸膏中黄酮含量（略）
       表3  正交设计及实验结果（略）
       最佳水平搭配A2B3C3；元素主次顺序A＞B＞C
       表4  方差分析结果（略）
       　3  讨论
       3.1  通过正交实验，从表2数据可见因素主次顺序A＞B＞C，最佳因素水平为A2B3C3。75%乙醇提取总黄酮得率最高，50%乙醇提取浸膏得率虽高，但黄酮含量较低，而且过滤困难，说明浸膏中无效成分（如糖、淀粉）较多，95%乙醇提取液浸膏量最少，糖类杂质少，但黄酮含量也最低，且叶绿素含量较高。而75%乙醇提取浸膏适中，浸膏中黄酮含量最高、杂质少、操作方便；溶剂量对总黄酮提取影响稍小，15倍量乙醇与20倍量乙醇总黄酮收率基本相当；提取时间因素的水平对总黄酮含量影响最小，几无差别。方差分析结果也证明溶剂用量、提取时间无显著影响。综合其他因素，从节约溶剂、能源和时间考虑，将B3改为B2，将C3改为C1,由此确定提取工艺为A2B2C1。即草中黄酮类成分回流提取的适宜工艺为：用75%乙醇，料液比为1∶15，回流提取2次，1 h/次。
       　参考文献：
       ［1］  尹海波，王  颖，郑太坤，等.中国草属植物的研究进展［J］.辽宁中医学院学报，2001，3 (1)：60.
       ［2］  盛 萍,王新铃,杨学斌,等.罗布麻总黄酮提取工艺的优选［J］.时珍国医国药，2006，17（4）：587.
       基金项目：浙江省嘉兴市科技局基金资助项目（No.2005AY3042）
       (嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴  314001；浙江大学医学院，浙江 杭州  310006)