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       【关键词】  猫爪草多糖；,,提取鉴别；,,免疫功能；,,环磷酰胺
       摘要：目的确定猫爪草多糖对实验动物免疫功能的影响。方法环磷酰胺造模法制作免疫抑制小鼠模型，灌胃给药，观察和比较猫爪草多糖对其腹腔巨噬细胞吞噬功能、溶血素形成以及外周血T淋巴细胞数的影响。结果猫爪草多糖可使吞噬百分率、吞噬指数显著升高；猫爪草多糖可显著促进溶血素的形成并提高外周血中T淋巴细胞数。结论猫爪草多糖对正常及免疫抑制小鼠均有免疫兴奋作用。
       关键词：猫爪草多糖；  提取鉴别；  免疫功能；  环磷酰胺
       The Study About Immunocompetence of Polysaccharide of Radix Ranunculi Ternati
       ZHANG Zhenling, WANG Lei, WU Xiaojing, ZHANG Huixia
       (Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of the polysaccharide on immune function.MethodsThe IS. model in Kunming mice was induced by Cyclophospharmude, and the phagoctosis of peritoneal macrophage, the formuation of hemoloysin and the number of T-lymphocytes in penpheral blood were observed.ResultsThe extract from Radix Ranunculi Ternati could elevate the percent and the index of phagocytosis, enhance the formation of the hemolysin obviously, and increase the number of T-lymphocytes in peripheral blood.ConclusionThe polysaccharide of Radix Ranunculi Ternati can stimulate the immunologic function of normal and IS. Kunming mice.
       Key words：The polysaccharide of Radix Ranunculi Ternatii;Extraction and discrimination;Immunity function;Cyclophosphamide
   
　　猫爪草为毛莨科植物小毛莨Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根。猫爪草性平，味甘、辛，性温，归肝、肺经。功能解毒、化痰散结，主治瘰疬未溃、淋巴结结核、咽炎等［1］。有报道猫爪草化学成分主要有糖16%、油1.2%及少量生物碱［2］。又有报道分离得到肉豆蔻酸十八烷基酯，二十烷酸，豆甾醇，β谷甾醇，小毛莨内酯，以及豆甾醇和β谷甾醇二者混合品的葡萄糖苷等7个化合物［3，4］，且含有多糖类成分。王爱武等［5］对其含量较高的两种主要提取物进行了体外抗肿瘤作用的初步研究。结果显示，猫爪草皂苷及多糖对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7的3种肿瘤细胞株的生长和集落形成均有不同程度的影响，皂苷比多糖抑瘤效果好。本研究主要提取猫爪草多糖确定是否具有免疫活性。
       1  器材
       1.1  药材购自河南淮滨县王岗乡毛庄村，经河南中医学院生药教研室董诚明教授鉴定为毛莨科植物小毛莨的干燥块根。
       1.2  试剂环磷酰胺（山西普德药业有限公司，批号20051201，规格200 mg×5瓶）；生理盐水（郑州化学药业有限公司，批号010409，规格500 ml/瓶）；瑞氏色素（上海试剂三厂，批号99030）；其余试剂药品均为分析纯。
       1.3  仪器BS210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司，max210 g,d 0.1 mg）；KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-40 B型低速台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；数码生物显微摄影系统（上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；载玻片（盐城市丽帆玻璃有限公司）。
       1.4  动物ICR小鼠，雌雄各半，18~20 g；鸡红细胞和豚鼠血清（郑州大学医学院动物实验中心）。
       1.5  猫爪草多糖的提取及试液配制
       1.5.1  猫爪草多糖的提取［6］本实验室综合相关文献并结合预实验自行提取。
       1.5.2  Hank’s应用液的配制取Hank’s原液1份加双蒸水9份混合分装，69.75kPa(10P/cm2)20 min高压灭菌，4℃冰箱备用。
       1.5.3  孵育液（酯酶染色液）的配制取1/15 mol/L pH 7.6的磷酸缓冲液89 ml缓缓加入六偶氮副品红6 ml，充分混匀后，再慢慢滴加2%α醋酸萘酯溶液2.5 ml，充分混匀，最后呈琥珀色混浊样液，调节pH到6.4。
       　2  方法［7~9］
       2.1  猫爪草多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响取小鼠按体重随机分为：①空白组，②CTX模型组，③治疗组，④多糖100 mg・kg-1。按0.2 ml・kg-1灌胃给药，1次/d，连续7 d，空白组给等 量生理盐水。除空白组、多糖组外，均ip CTX 40 mg・kg-1制备免疫低下模型。第7天每鼠腹腔注射5%的鸡红细胞生理盐水混悬液（0.2 ml/10 g），于注射鸡红细胞6 h和最后1次灌胃2 h后，脱颈椎处死小鼠，用酒精棉球消毒腹部皮肤，腹腔注射Hank’s液2.5 ml，轻揉小鼠腹部，在腹膜上剪一小孔，吸出腹腔液后滴少许在载玻片上并推片，稍干后瑞氏染液染色，自来水冲洗，晾干，显微镜下观察。见图3。计算小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞吞噬百分率和吞噬指数［10，11］，其中吞噬百分率=（吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数/100个巨噬细胞）×100%；吞噬指数=100个巨噬细胞所吞噬的鸡红细胞数/100。结果见图1及表1。
       图1  小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬的显微图（略）
       表1  猫爪草多糖对正常及免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（略）
       与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；n=10上述结果说明，猫爪草多糖可明显提高正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，并能拮抗环磷酰胺所致的免疫抑制作用。
       2.2  猫爪草多糖对正常及免疫抑制小鼠溶血素形成的影响取小鼠按上述方法分组，各组均于第1天每鼠腹腔注射5%的鸡红细胞、生理盐水混悬液0.2 ml进行免疫，于第7天给药后2 h，小鼠眼眶取血，离心取血清，用生理盐水1∶100稀释后，取1 ml与5%的鸡红细胞混悬液0.5 ml，10%补体0.5 ml混匀，另设不加血清的对照管，将混悬液充分混匀，在37℃恒温箱中温育30 min，在冰水中中止反应，离心，取上清液于540 nm处比色，以空白管调“0”点，测各管的吸收度［10，11］。结果见表2。
       表2  猫爪草多糖对正常及免疫抑制小鼠溶血素形成的影响（略）
       与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；n=10
       猫爪草多糖能提高正常小鼠血清溶血素的含量，并能拮抗环磷酰胺对体液免疫的抑制作用。
       2.3  猫爪草多糖对正常免疫抑制小鼠外周血T淋巴细胞数的影响取小鼠按上述方法分组，于灌胃的第1天每鼠腹腔注射环磷酰胺（40 mg/kg,0.1 ml/10 g），连续8 d，另设一完全空白对照组，腹腔注射并灌服同体积的生理盐水。于末次给药后1 h，摘眼球取血推片，自然风干燥后，浸入孵育液（预热30 min）中37℃孵育3 h，自来水冲洗片刻（以冲洗沉渣为度），用滤纸收干水珠，加1%孔雀绿溶液染色5~10 s，自来水冲洗，滤纸轻吸，晾干后油镜检查。淋巴细胞核较大且呈圆形不分叶，染成绿色，胞浆呈紫蓝色。T淋巴细胞胞浆中呈现大小和数量不等的黑红色颗粒（一般2~5个）， 非T 淋巴细胞 的胞浆中无颗粒。计数100个淋巴细胞，计算T淋巴细胞 的百分比，比较给药组与对照组小鼠外周血中T淋巴细胞百分比的差异。结果见表3。从上述实验数据可以看出，环磷酰胺组T细胞百分比明显低于空白组，而治疗组的T细胞与空白组比较均无明显差异，这说明猫爪草多糖可以拮抗环磷酰胺对细胞免疫的抑制作用。并且多糖还对正常小鼠的细胞免疫有明显的增强作用。
       表3  猫爪草多糖对正常及免疫抑制小鼠外周血T淋巴细胞数的影响（略）
       与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；n=10
       　3  讨论
       3.1  经鸡红细胞致敏过的动物血清中的另一循环抗体-溶血素（IgM），与鸡经细胞一起体外温育，在补体参与下产生溶血反应。致敏动物血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白量来检测。溶血素水平反映体液免疫能力，与机体体液免疫能力呈正相关系。猫爪草多糖能提高小鼠血清溶血素的含量，并能拮抗环磷酰胺所致的体液免疫抑制，说明猫爪草多糖能提高机体体液免疫能力。
       3.2  猫爪草在河南、安徽等地有野生和大量种植，临床具有抗肿瘤和抗结核作用，本研究证明猫爪草含有多糖，并具有兴奋免疫活性，为临床应用和开发提供了研究基础。
       参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：223.
       ［2］  李嘉玉，刘道矩，刘济宽.中药猫爪草治疗颈淋巴结结核180例的分析［J］.天津医药杂志，1964，6（11）：958.
       ［3］  姜达衡，黄筱美.猫爪草化学成分的研究［J］.中国中药杂志，1993，18（9）：550.
       ［4］  郭学敏，周卓轮，洪永福.猫爪草化学成分研究［J］.药学学报，1995，30（12）：931.
       ［5］  王爱武，王  梅，袁久荣，等.猫爪草提取物体外抗肿瘤作用的研究［J］.天然产物研究与开发，2004，16（6）：529.
       ［6］  王鲁石，杜  华，薛  梅，等.猫爪草多糖的提取及含量测定［J］.新疆中医药，2003，21（3）：9.
       ［7］  徐叔云，卞如濂，陈  修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1982：946.
       ［8］  李仪奎.中药药理研究方法学［M］.上海：上海科学技术出版社，1991：153，163.
       ［9］  陈  奇.中药药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1994：750，1010.
       基金项目：河南省重大科技攻关指标项目(No.052203,0200)
       (河南中医学院，河南 郑州  450008)