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       【关键词】  黄芩茎叶总黄酮；,,肝细胞；,,原代培养；,,保护作用；,,机制
       摘要：目的研究黄芩茎叶总黄酮（SSTF）对原代培养大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用及其机理。方法采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养，用H2O2和CCl4体外诱导肝细胞损伤，同时加以不同浓度的SSTF对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性、肝细胞内丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性，MTT法测定肝细胞增殖活性。结果与模型组比较，SSTF明显抑制H2O2和CCl4引起的肝细胞培养液中ALT活性的升高，肝细胞存活率明显升高，还可明显恢复H2O2引起的肝细胞MDA含量的升高和GSHpx 活性的降低明显。结论 SSTF对培养大鼠肝细胞损伤有明显的保护作用，其机制可能与其抗脂质氧化作用有关。
       关键词：黄芩茎叶总黄酮；  肝细胞；  原代培养；  保护作用；  机制
       Study on the Protective Effect and Possible Mechanism of Scutellaria baicalensis Stem-leaf Total Flavonoid on Primary Cultured Rat  Hepatocytes Injured by H2O2 or CCl4
       LI Suting,YANG HeMei,  ZHOU Xiaohui
       (Chengde  Medical  College, Chengde  067000，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effect and possible mechanism of Scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid(SSTF) on primary rat  hepatocyes  injured by H2O2 or CCl4.MethodsPrimary  hepatocytes were isolated,cultured  by trypsin digestion and induced by H2O2 or CCl4.Various  concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes .The contents of malondialdehyde(MDA) and activity of glutathion peroxidase(GSH-px) in hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods,the viabilities of hepatocytes were measured by MTT. ResultsCompared with model group, SSTF could restore remarkably ALT level in supermatant of cultural hepatocytes, decrease MDA  content  and elevate GSHpx activity of  hepatocytes ,hepatocyte viabilities increased significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary rat  hepatocyes  injured by H2O2 or CCl4. These might be associated with its antilipoperoxidation function.
       Key words：SSTF;   Hepatocytes ;   Primary cultured ;   Protective effect;   Mechanism.
    
　　黄芩茎叶总黄酮（Scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid ，SSTF）是承德医学院中药研究所从唇型科植物黄芩的茎叶部分提取的有效成分，整体实验已证实SSTF具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化及保肝等作用［1～4］。为进一步研究SSTF保肝作用及其机制，本文采用胰蛋白酶消化法分离肝实质细胞进行体外培养，用CCl4和 H2O2体外诱导肝细胞氧化损伤模型，在细胞水平上证实SSTF对肝细胞损伤的保护作用及其机制，为进一步阐明SSTF的药理作用及中药新药的研发和应用提供可靠依据。
       　1   材料与方法
       1.1  药品与试剂  SSTF（含总黄酮73%）：承德医学院中药研究所提供，临用前以蒸馏水配制，用饱和碳酸氢钠调pH=7.6；Hanks液高压灭菌，4℃保存；0.80 g・L-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH7.2，分装,-30℃保存；1%PVP：北京华美公司提供；基础培养液：RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1000 ml，过滤除菌，临用前每80ml，加入新生小牛血清20ml，青霉素100 μg・ml-1，链霉素100 μg・ml-1，胰岛素5 μg・ml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-Px测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。
       1.2  动物2~3 d龄SD大鼠乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。
       1.3  仪器 CO2培养箱（Taibai LNA122D 日本），MD100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。
       1.4  肝细胞分离培养［5］取新生SD大鼠10只，75%酒精中浸洗后断头处死，无菌分离肝脏，迅速置Hanks液中，用Hanks冲洗数次除去血污，剥除被膜和纤维成分，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，加入0.80 g・L-1胰蛋白酶和1%PVP，37℃消化5~8 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗3次，1800 r/min离心5 min，收集肝细胞并计数，按1 ×109个・L-1，接种于铺有多聚赖氨酸的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养，4 h首次换液去除血细胞，以后每24 h换液1次。
       1.5   SSTF对H2O2诱导肝细胞损伤的影响取上述原代培养48 h肝细胞，设H2O2损伤模型组、SSTF(50 mg・L-1，100 mg・L-1，200 mg・L-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和保护组加入H2O2 0.5 mmol・L-1，同时保护组加入不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养4h，收集24孔板中培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞测定MDA含量和GSH-PX活性，MTT比色法测定96孔板中肝细胞的存活率。
       1.6   SSTF对CCl4 诱导肝细胞损伤的影响设CCl4损伤模型组、SSTF(50 ，100 ，200 mg・L-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。肝细胞培养24h后换液，模型组和SSTF组加入CCl4(二甲基亚枫配制)，终浓度为10 mmol・L-1，同时SSTF组加入不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养6 h，收集24孔板中培养上清液检测ALT活性， MTT比色法测定96孔板中肝细胞的存活率。
       1.7  统计学处理  数据以(±s)表示，用SPSS计算机软件进行统计学分析, 组间比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。
       　2  结果
       2.1  SSTF对损伤肝细胞的影响 H2O2 作用肝细胞4 h后，模型组肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，肝细胞活性明显下降，培养上清液内ALT释放量明显升高，肝细胞内MDA含量明显升高，GSH-Px活性明显降低；而加入SSTF保护后，各保护组ALT活性明显降低，MDA含量明显降低，GSH-Px活性明显升高。并且SSTF在剂量范围内与模型组比较肝细胞活性显著提高，且剂量越高，细胞存活率越高，存在明显的剂量依赖性。表明SSTF能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构和功能。并且具有明显的清除自由基抗脂质过氧化作用。
       表1  SSTF 对H2O2 损伤肝细胞的影响（略）
       与对照组比较*P＜0.01，与模型组比#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
       2.2   SSTF对 CCl4 损伤肝细胞的影响原代培养肝细胞与CCl4作用6 h后，可使培养上清液内ALT释放量明显升高，肝细胞存活率明显下降；而SSTF各保护组，ALT活性明显降低，肝细胞活性明显升高，表明SSTF对CCl4肝细胞损伤有明显保护作用。
       表2  SSTF 对CCl4损伤肝细胞的影响（略）
       与对照组比较*P＜0.01,与模型组比#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
       3   讨论
       在多种因素(药物、毒物、乙醇等)引起的肝细胞损伤中，氧化应激是它们的共同损伤机制［6］。肝细胞受到氧化损伤时，自由基及其过氧化反应产物破坏细胞膜和细胞结构，导致细胞肿胀坏死, 并可使细胞内清除自由基酶（SOD，SH-Px）的活性下降，导致其清除自由基能力下降，使肝细胞损伤进一步加重，膜通透性升高，肝细胞内ALT，ST等酶外逸，细胞肿胀死亡［7］。H2O2是一种重要的活性氧，极易通过细胞膜与细胞内铁离子反应形成高活性OH・损伤肝细胞，CCl4在肝细胞内代谢也可产生为具有高度反应活性的・CCl3，OOCCl3等自由基引起肝细胞损伤［8］。据此，我们采用原代培养大鼠肝细胞，以H2O2和CCl4体外诱导肝细胞氧化损伤模型，选择培养上清液中ALT活性、肝细胞MDA含量和GSH-Px活性作为判断肝细胞损伤和SSTF保护作用的检测指标。本研究结果显示，H2O2和CCl4损伤肝细胞后，均可使培养上清液中ALT活性明显升高，细胞存活率明显下降，而给予SSTF保护后，培养上清液中AST活性可明显降低，肝细胞活性明显提高。表明SSTF对肝细胞氧化损伤有明显的保护作用；研究表明，黄酮类化合物具有很强的除自由基和抑制脂质过氧化特性［9］，SSTF是含有多个羟基的黄酮类化合物，具有较强的抗氧化作用［2］。本研究结果进一步显示，SSTF能明显抑制H2O2损伤肝细胞内MDA含量的升高和GSH-Px活性的降低，表明SSTF之所以对肝细胞氧化损伤有一定的保护作用，其机制可能是：SSTF通过提高清除自由基酶的活性，拮抗自由基引起脂质过氧化反应,保护了肝细胞结构和功能的完整性，避免肝细胞遭受各种氧化损伤。
       　　参考文献：
       ［1］  周晓霞，李素婷，周晓慧，等. 黄芩茎叶总黄酮抗炎作用的实验研究［J］.中国中医药信息杂志，2000，7（4）：27.
       ［2］  李素婷，王海林，杨鹤梅,等. 黄芩茎叶总黄酮对脑缺血的保护作用［J］.中国中医基础医学杂志, 2001，7（1）：35.
       ［3］  佟继铭，刘玉玲，周崇坦，等. 黄芩茎叶总黄酮对家兔实验性动脉粥样硬化的预防作用［J］.中草药, 2005,36(1)：93.
       ［4］  李素婷，杨鹤梅，石艳华，等.黄芩茎叶总黄酮保肝作用的实验研究［J］.中国中医药信息杂志，2004，11（7）：593.
       ［5］  那广水，于洪儒，王洪新，等.一种小鼠原代肝细胞培养方法［J］.锦州医学院学报，2003，24（3）：22.
       ［6］  Tribble  DL,Aw TY,Jones DP. The pathophysiological  sigificance of lipidperoxidation in oxidative cell injury［J］. Hepatology,1987，7：377.
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       ［8］  杨  雁，陈敏珠. 黄芪总提物对体外肝细胞损伤的保护作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2000，5（4）：294.
       ［9］  先  宏. 中药抗氧化性的主要成分及其自由基消除作用［J］.国外医学中医中药分册，2003，25（3）：250.
       (承德医学院，河北 承德  067000)