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       【关键词】  反相高效液相色谱法；,,关节克痹丸；,,大黄素
       摘要：目的建立反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定关节克痹丸中大黄素的含量。方法采用Zobax C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以甲醇0.1%磷酸溶液（70∶30）为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长282 nm，柱温40℃。结果大黄素在0.01~0.2 mg/ml范围内线性关系良好（r=0.999 9），平均回收率为97.56%，RSD为1.51%。结论 该法操作简便，结果准确、可靠，可作为关节克痹丸的质量控制标准之一。
       关键词：反相高效液相色谱法；  关节克痹丸；  大黄素
       Determination of Emodin in Guanjiekebi Pill by RP-HPLC
       GU Zhengrong,CHENG Chen
       (Changzhou Institute for Drug Control,Changzhou 213002,China)
       Abstract：ObjectiveAn RP-HPLC method was established for the determination of emodin content in Guanjiekebi pill.MethodsZobax C18(4.6 mm×150 mm，5 μm) was used with a mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid(70∶30).The detection wavelength was 282 nm,the flow rate was 1.0 ml/min,and the temperature of the column was 40℃.ResultsThe linear range of emodin was 0.01~0.2 mg/ml(r=0.999 9),while the average recovery was 97.56%(RSD=1.51%).ConclusionThe method is simple,sensitive and accurate.It can be applied in quality control of Guanjiekebi  pill.
       Key words：RP-HPLC;  Guanjiekebi pill;  Emodin
   
　　关节克痹丸由川乌（制）、草乌（制）、虎杖、独活、秦艽、麻黄等15味中药组成，具有祛风散寒、活络止痛功效［1］。临床主要用于关节炎，四肢酸痛，伸展不利。其质量标准中缺少含量测定方法。本文采用反相高效液相色谱法［2］测定该中成药虎杖中大黄素的含量。现将结果报道如下。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器Agilent 1100 LC系统（美国惠普公司）：四元泵、在线真空脱气机、可变波长紫外检测器（VWD）、Agilent ChemStation  工作站；FA2004电子分析天平（上海天平仪器厂）、BP211D电子分析天平（德国Starforias公司）；HS2005D超声波洗涤器（天津鑫洲科技公司）。所用仪器和量具均经校正和检定。
       1.2  材料大黄素对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号110756200110）；关节克痹丸及其空白制剂（江苏天士力制药有限公司提供）；甲醇为色谱纯，水为纯净水，其它试剂为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱为Zobax C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇0.1%磷酸溶液（70∶30）；检测波长 282 nm；柱温40℃；流速1.0 ml/min；进样量10   μl（定量环）。
       2.2  溶液的制备
       2.2.1  对照品溶液的制备精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的大黄素对照品11.02 mg，置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.110 2 mg/ml的对照品溶液。
       2.2.2  供试品溶液的制备取样品3 g，研细，精密称定，置250 ml具塞三角瓶中，精密加入甲醇100 ml，密塞，称定重量，置水浴加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸收续滤液50 ml置蒸发皿中，蒸干，残渣加5 mol/L盐酸30 ml及氯仿30 ml，水浴加热回流30 min，冷却，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，分取氯仿液，酸液再用氯仿提取4次，20 ml/次。合并氯仿液，蒸干，并转移至10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜滤过，作为供试品溶液。
       2.3  标准曲线［3］精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的大黄素对照品10 mg置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。用甲醇配成浓度为：0.01，0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg/ml的标准液，按上述色谱条件分别进样10μl，测定峰面积。以对照品浓度（mg/ml）为横坐标（C），峰面积为纵坐标（A）绘制标准曲线，得大黄素的回归方程为：A=10.439 02+51 608.214 27C (r=0.999 9)；大黄素浓度在0.01~0.2 mg/ml范围内呈良好的线性关系。
       2.4  精密度实验取浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液在上述色谱条件下重复进样5次，10 μl/次，测定峰面积，结果RSD为0.15%（n=5）。
       2.5  稳定性实验取同一样品溶液分别于0，0.5，1，3，5，8 h进样测定峰面积，结果RSD为0.4%(n=6)，表明样品在8 h内稳定。
       2.6  重复性实验取同一样品（批号 0601002）6份，分别精密称定，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件测定，计算含量，RSD为1.36%。
       2.7  加样回收率实验精密称取已知含量的样品（0.746 6 mg/g）适量，分别精密加入大黄素对照品（0.204 6 mg/ml）5 ml，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件测定，测得平均回收率为97.56%，RSD为1.51%。结果见表1。
       表1  加样回收实验结果（略）
       2.8  空白干扰实验取空白制剂按供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10 μl，进样，记录色谱图。从图中可见，大黄素色谱峰峰形对称，供试品色谱图中大黄素峰能与其它成分很好地分离，阴性供试品在大黄素峰处基本无干扰，色谱图清晰。结果见图1~3。
       图1  大黄素对照品色谱图（略）
       图2  供试品色谱图（略）
       图3  阴性对照品色谱图（略）
       2.9  样品含量测定按2.2.2项下操作分别对3批样品按上述含量测定方法进行测定，计算含量。结果见表2。
       表2  样品含量测定结果（略）
       3  小结
       3.1  指标性成分的确定关节克痹丸处方中虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zuce.的干燥块根，有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的作用。其主要成分之一为蒽醌类化合物大黄素（Emodin）。大黄素一般以游离型和结合型两种形式存在，生产过程中往往会造成部分结合型大黄素水解，因此测定中成药水解后大黄素总量作为质量控制指标较为合理。
       3.2  水解酸的选择在供试品制备中，水解酸试用过盐酸和硫酸液，但硫酸液使氯仿液蒸干后有棕黑色残渣，而盐酸无此现象，确定用盐酸作为水解液。
       3.3  提取条件的优选为能从样品中最大限度地提取大黄素，比较用氯仿回流与超声提取，回流提取含量明显高于超声提取。结果确定提取条件为回流提取， 并且确定氯仿用量为30 ml，时间为30 min。
       3.4  检测波长的选择取大黄素对照品溶液，通过紫外扫描，检测波长在282 nm处吸光度最强，本文选择在282 nm处测定大黄素含量，结果比较理想，峰形较好，干扰较少。
       3.5  流动相的选择对流动相配比进行了考察，当配比在70∶30时，色谱峰峰形对称，且能与其它成分很好地分离。
       3.6  质量控制用HPLC法测定虎杖中大黄素的含量，制剂的前处理简便，可操作性强，分离度及重现性好，为该制剂的质量控制提供一种简便准确的分析方法。
       参考文献：
       ［1］  中华人民共和国药典委员会.卫生部药品标准・中药成方制剂，第20册［S］.1998：87.
       ［2］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：145.
       ［3］  马春云，徐志红.高效液相色谱法测定鱼屋列舒颗粒中大黄素的含量［J］.中国药业，2004，13（1）：52.
       (江苏省常州药品检验所  213002)