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       【关键词】  高效液相色谱法；,,风热感冒片；,,连翘苷；,,牛蒡子苷
       摘要：目的建立风热感冒片中连翘苷及牛蒡子苷的含量测定方法。方法采用HPLC法，测定风热感冒片中连翘中连翘苷和牛蒡子中牛蒡子苷的含量。结果连翘苷在0.207～2.072    μg范围内线性关系良好（r=0.999 8），平均回收率99.87%，RSD=1.43 %（n=9）。牛蒡子苷在0.186～4.26 μg 范围内线性关系良好(r =0.999 7)，平均回收率99.30%, RSD=1.08%（n=9）。结论 该法专属性强，重现性好，可作为风寒感冒片中连翘苷和牛蒡子苷的含量测定方法。
       关键词：高效液相色谱法；  风热感冒片；  连翘苷；  牛蒡子苷
       Determination of Forsythin and Arctiin in Fengreganmao Tablets  by RPHPLC
       YAN Genquan，HE Yingju*，MO Yi, CHEN Yan, LIN Liyang
       (West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041，China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of forsythin and arctiin in Fengreganmao tablets. MethodsThe forsythin and arctiin in fengreganmao tablets of arctii were determined by HPLC.ResultsThe calibration curve of forsythin was linear with 0.207～2.072 μg(r =0.999 7).The average recovery of forsythin was 99.87% with RSD=1.43%(n=9). The calibration curve of arctiin was linear with 0.186～4.26μg (r=0.999 7) .The average recovery of arctiin was 99.30% with RSD=1.08%(n=9).ConclusionThe method is exclusive and reproducible.It could be applied to determine forsythin and arctiin in Fenghanganmao tablets.
       Key words： HPLC;  Fengreganmao tablets;  Forsythin;  Arctiin
   
　　本品为板蓝根、连翘、牛蒡子等11味药材经加工制成的新型中药制剂，具有清热祛湿、凉血解毒的功效，用于风热感冒、温病发热、上呼吸道感染，流感及腮腺炎等疾病的治疗。方中板蓝根、连翘为君药。板蓝根主要有效成分为靛蓝和靛玉红，关于二者的含量测定方法我们进行了研究，由于制剂中靛蓝和靛玉红含量较低，且不稳定，故未将此法收入标准。连翘是木犀科植物连翘的干燥果实，具有清热解毒、宣散风热、消痈散结之功效。近年来药理研究证明连翘有较广的抗菌作用，对G＋，G-菌及流感病毒均有明显的抑制作用［1］，能有效反映风热感冒片的药效。连翘中连翘苷为其主要有效成分，化学性质稳定，国内含连翘药材的中药制剂多以连翘苷为其含量测定的指标成分。方中牛蒡子具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽之功效，用于治疗风热感冒、咳嗽痰多、咽喉肿痛、痈肿疮毒［2］，其主要有效成分是以牛蒡子苷［3］为主的木脂素类化合物，且牛蒡子苷含量较高易于测定。因此，我们选择了连翘苷和牛蒡子苷作为指标成分，应用高效液相色谱法进行含量测定，以达到控制风热感冒片的质量的目的。
       1  仪器与试药
       日本岛津高效液相色谱仪：LC10AT VP 泵和SPD10A VP 紫外可见光检测器；德国Sartorius公司BP210S电子天平；LC2002色谱工作站； SB3200超声清洗器（国产）。连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110821200305，供含量测定用）；牛蒡子苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号200203，供含量测定用）；甲醇为色谱纯，水为超纯水；其它试剂为分析纯；风热感冒片（0.54 g/片，自制）。
       　2  方法与结果
       2.1  连翘苷含量测定方法的建立
       2.1.1   色谱条件色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm×250 mm ，5 μm），流动相为甲醇水(41∶59)；流速1.0 ml・min-1；检测波长279 nm；柱温28 ℃。理论塔板数按连翘苷计算不得低于3000。
       2.1.2   对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品10 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀。即得连翘苷对照品贮备液（200 μg・ml-1）。精密吸取贮备液10 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得连翘苷对照品溶液（80 μg・ml-1）。
       2.1.3  供试品溶液的制备取本品10片，研细，精密称取细粉0.5 g，置锥形瓶中，加甲醇50 ml，超声处理30 min，滤过，收集滤液，滤渣及容器用甲醇洗涤2次，5 ml/次，合并滤液。将滤液浓缩至约15 ml，上中性氧化铝柱［4］（15 g，50 cm×1.5 cm），50%甲醇60 ml洗脱，收集洗脱液，将洗脱液挥干，去离子水15 ml溶解残渣，醋酸乙酯萃取5次，15 ml/次，收集乙酸乙酯液，挥干，用甲醇溶解残渣，定容于25 ml量瓶，滤过，将续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
       2.1.4  线性范围的考察  精密吸取连翘苷对照品贮备液5.0，7.5，12.5 μl ，连翘苷对照品溶液2.5，5.0，7.5，10.0 μl进样，记录色谱图。以连翘苷的质量（M）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为A = 1.246×106M+8.898×103，r=0.999 8， 连翘苷在0.207～2.072 μg范围内存在良好的线性关系。
       2.1.5   方法专属性按同样工艺制备缺连翘药材的阴性对照片，再按“2.1.3”项下方法制备阴性供试品溶液。分别取连翘苷对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，色谱图见图1~3。结果表明阴性对照无干扰。
       2.1.6  进样精密度实验  取连翘苷贮备液10 μl，连续进样6次，其峰面积RSD=0.44%，表明进样精密度良好。
       2.1.7  供试品溶液稳定性实验  按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液1份，分别在0，2，4，6，8，10 h进样，记录峰面积，RSD=0.88%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。
       图1  连翘苷阴性供试品色谱图（略）
       图2  连翘苷对照品色谱图（略）
       图3  供试品色谱图(峰1为连翘苷色谱峰)（略）
       2.1.8  重复性实验 取本品细粉0.5 g，6份，按“2.1.10”项下方法测定，6份样品连翘苷含量的RSD=1.78%。
       2.1.9  加样回收率实验称取本品细粉9份，按高、中、低浓度分成3组，每组3份。分别加入定量的连翘苷对照品，按“2.1.10” 项下方法测定，平均回收率为99.87%, RSD=0.50%(n=9)。
       2.1.10  样品含量测定取本品3批，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μl进样，按外标法计算含量。3批样品连翘苷含量(mg/片)分别为0.49，0.47，0.48，平均值为0.48。
       2.2  牛蒡子苷含量测定方法的建立
       2.2.1  色谱条件Kromasil C18（4.6 mm×250 mm ，5 μm），流动相为乙腈水(26：74)；流速1.0 ml・min-1；检测波长279 nm；柱温40 ℃。理论塔板数按牛蒡子苷计算不得低于3 000。
       2.2.2   牛蒡子苷对照品溶液的制备精密称取牛蒡子苷对照品（五氧化二磷干燥器减压干燥24 h）37 mg，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容；精密吸取5 ml溶液，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，收集续滤液，即得牛蒡子苷对照品溶液一（0.074 mg・ml-1）。精密称取牛蒡子苷对照品（五氧化二磷干燥器减压干燥24 h）10 mg，置25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，收集续滤液，即得牛蒡子苷对照品溶液二（0.40 mg・ml-1）。
       2.2.3  供试品溶液的制备取本品10片，研细，精密称取细粉0.5 g，置100 ml棕色量瓶中，用甲醇定容，超声处理30 min，冷却至室温，用甲醇补足损失的量，摇匀，滤过，取续滤液2 ml置10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，收集续滤液，即得供试品溶液。
       2.2.4  线性范围的考察取牛蒡子苷对照品溶液一2.5，5.0，10.0，12.5 μl ，牛蒡子苷对照品溶液二5.0，10.0 μl进样，记录峰面积，以牛蒡子苷的质量（M）为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为A = 1.091×106M+4.890×103，r =0.999 7， 牛蒡子苷在0.186 ～4.26 μg范围内存在良好的线性关系。
       2.2.5  方法专属性按同样工艺制备缺牛蒡子药材的阴性对照片，再按“2.2.3”项下方法制备阴性供试品溶液。分别取牛蒡子苷对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，色谱图见图4~6。结果表明阴性对照无干扰。
       图4  牛蒡子苷阴性供试品（略）
       图5  牛蒡子苷对照品（略）
       图6  供试品色谱图（略）
       2.2.6  精密度实验取牛蒡子苷对照品溶液10 μl，连续进样6次，其峰面积的RSD=0.42%，表明进样精密度良好。
       2.2.7  供试品溶液稳定性实验 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液1份，分别在0，2，4，6，8，10 h进样，峰面积RSD=0.64%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。
       2.2.8  重复性实验取本品细粉0.5 g，6份，按“2.2.10”项下方法测定，6份样品中牛蒡子苷含量的RSD=0.98%。
       2.2.9  加样回收率实验称取本品细粉9份，按高、中、低浓度分成3组，每组3份。分别加入定量的牛蒡子苷对照品，按“2.2.10” 项下方法测定，平均回收率为99.30%, RSD =1.08%(n=9)。
       2.2.10  样品含量测定取本品3批，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μl进样，按外标法计算含量。3批样品牛蒡子苷含量(mg/片)分别为14.09，14.19，14.12，平均值为14.13。
       3  讨论
       在参考文献的基础上，分别考察了不同流动相（甲醇-水系统、乙腈-水系统）、不同柱温、不同检测波长下连翘苷与其他成分的分离情况。结果表明：乙腈-水系统基线较高且波动大；甲醇-水系统基线平稳，分离较好。连翘苷在205，228 nm下检测信号比较灵敏，但是其他成分对连翘苷存在较大干扰，采用277nm为佳。柱温对柱效、分离影响较大，在28℃时分离情况、峰形最好。连翘苷含量测定用供试品溶液制备曾采用甲醇提取后直接进样、正丁醇萃取［5］、氯仿萃取等方式，结果表明前者分离不好、后两者连翘苷提取效率低，因而采用常见的中性氧化铝柱进行样品预处理。牛蒡子药材中牛蒡子苷的含量较高,通常在5%以上。药理研究表明，牛蒡子苷对多种致病性真菌有不同程度的抑制作用,是牛蒡子的主要有效成分。临床用于治疗风热感冒、咽喉肿痛、麻疹不透、痈肿疮毒、痄腮喉痹。故选用牛蒡子苷作为指标成分之一控制风热感冒片的质量。
       参考文献：
       ［1］  牛新华.连翘体外抑菌作用的研究［J］.时珍国医国药，2002，13（6）：342.
       ［2］  国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2002.
       ［3］  任常胜，朱庆玲.牛蒡子的研究概况［J］.中国民族医药杂志，2003，12:36.
       ［4］  王  雪,王大果,晁若冰，等. HPLC法测定连翘和银甲妇康液中连翘苷的含量［J］.药物分析杂志,2000,2：92.
       ［5］  韩桂茹,董占军.小儿感冒颗粒的薄层鉴别和定量测定研究［J］.中成药,2004,26（11）：891.
       (四川大学华西药学院，四川 成都 610041)