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       【关键词】  厚朴酚；,,和厚朴酚；,,萃取；,,反相高效液相色谱；,,含量
       摘要：目的研究厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的快速提取及测定。方法采用正交实验用ASE300快速溶剂萃取机进行提取方法的研究，用HPLC法厚朴酚及和厚朴酚的含量测定，流动相为甲醇水冰醋酸（85∶15∶0.25），流速为1.0 ml/min，检测波长为294 nm，柱温为23℃。结果研究表明，用60%的乙醇，71℃的提取温度在快速萃取系统提取3次（10 min/次），厚朴中的厚朴酚、和厚朴酚以及总酚的提取率分别为94.59%，85.45%和88.81%；RP-HPLC方法较好，结果理想。结论 该研究得到了很好的快速提取及测定厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的方法。
       关键词：厚朴酚；  和厚朴酚；  萃取；  反相高效液相色谱；  含量
       A Study on The Extracting and Determining Method for Magnolol and Honokiol in Magnolia offcinalis Rend et Wils
       LIU Xiaopeng ,  JIANG Ning ， XIANG Dongshan, ZHOU Dazhai, ZHANG Chi, WU Yongyao
       (Research Institute of Biotechnology, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000，China; Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000，China; School of Biological Science and Technology , Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000，China)
       Abstract：ObjectiveTo Study the quick extracting and determining methods for Magnolol and Honokiol in Magnolia offcinalis Rend et Wils.MethodsThe method of extracting Magnolol and Honokiol was extraction with the ASE300 system by orthoplan and the method of determination was deteminedby HPLC.Results60% alcohol and extracting three times for ten minutes each time at 71℃ was the optimal extracting coondition. The RP-HPLC was simple,rapid and accurate.ConclusionThe extracting and determining methods are practicale for Magnolol and Honokiol in Magnolia offcinalis Rend et Wils.
       Key words：Magnolol；   Honokiol；  Extraction；  RPHPLC；  Content
   
　　厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia offcinalis Rend et Wils的干皮、根皮或枝皮(称枝，性温味苦辛，无毒，入脾、胃、大肠经，能温中下气，燥湿消痰。厚朴是一种极为重要的中药材。厚朴在我国已有两千多年药用历史，用于治疗多个系统和器官的疾病，我国很多民间验方如厚朴三物汤、平胃散、大承气汤、四七汤和栀子厚朴汤中都含有生药厚朴；2005版《中国药典》Ⅰ部中有包括藿香正气水、香砂养胃丸、开胸顺气丸、柴胡舒肝丸等20多个常用中成药的主要原料药均含厚朴［1］。现代药理学研究表明,厚朴具有抗菌、抗病毒、抗过敏、影响胃肠活动、肌肉松弛和中枢抑制等作用［2］。厚朴药材中含酚性化合物9种，挥发油成分30种，生物碱9种以及其它一些化学成分。其中，厚朴酚及其异构体和厚朴酚占绝对优势。这两种酚的含量是评价厚朴药材品质优劣的标志［3］。2005版《中国药典》规定，厚朴中酚含量大于2%为合格品（采用《中国药典》的HPLC法测定）《中国药典》提取方法为甲醇浸渍24 h，方法虽然简单，但提取率以及准确度有限且费时，全面提取及测定其有效成分含量是一项重要而有意义的工作。本研究利用美国DIONEX公司的快速萃取系统及HPLC系统，进行了快速准确提取及测定厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的研究，结果理想，报告如下。
       1  材料与方法
       1.1   材料与试剂厚朴皮取自湖北恩施市双河乡，为紫油厚朴的干燥发汗树皮。提取用无水乙醇、甲醇为分析纯，HPLC甲醇为色谱纯， 厚朴酚、和厚朴酚标准品由中国药品生物制品检定所提供。
       1.2   仪器美国DIONEX公司ASE300型加速溶剂萃取机，66 ml萃取池；美国DIONEX公司P680LPG型高效液相色谱仪；RE52型旋转蒸发仪。
       1.3   方法
       1.3.1   厚朴皮中酚类物质的全提取取干燥的发汗厚朴皮,粉碎，过60目筛，取适量用无水乙醇于索氏抽提器中提取至无色为止；用旋转蒸发仪浓缩后定容,取样用甲醇稀释10倍后进行HPLC测定含量，3次重复。
       1.3.2   厚朴皮中酚类物质的快速萃取采用正交实验L9（34）用ASE300型快速溶剂萃取机进行提取方法的研究，正交实验的因素水平表见表1；取前述干燥的厚朴皮粉，按4∶1的比例加入硅藻土混匀后装入萃取池，编程进行萃取实验（萃取压力均为1500 psi）,萃取结束后定容萃取液并取样，用甲醇稀释10倍后进行HPLC测定含量。
       表1  因素水平表（略）
       1.3.3   色谱条件与系统适用性实验色谱柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇水冰醋酸(85∶15∶0.25)，流速1.0 ml/min，检测波长294 nm，柱温23℃，进样量20 μl。
       1.3.4   线性范围考察精密称取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加甲醇制成每毫升含厚朴酚以及和厚朴酚均为400，200，100，50，25，12.5，6.25 μg的标准品浓度梯度，分别吸取溶液20 μl ，注入HPLC仪测定。以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。
       1.3.5   精密度实验取厚朴酚以及和厚朴酚浓度为100 μg/ml的对照品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算RSD。
       1.3.6  重复性实验取索氏提取的一个样品，依法平行测定5次，记录厚朴酚与和厚朴酚的色谱峰面积，计算RSD。
       1.3.7   稳定性实验取索氏提取的一个样品，每隔2 h进样1次，共进样5次，考察供试品溶液的稳定性。
       1.3.8  回收率实验取已测知含量的样品5份，分别精密加入对照品适量，依RPHPLC法测定，计算回收率，RSD。
       　　2  结果
       2.1   HPLC结果及标准品线性关系在前述色谱条件下，厚朴酚与和厚朴酚与其他成分能够很好地分离（见图1）；以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。厚朴酚浓度在6.25～400 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。回归方程为：厚朴酚Y=0.435 991X+3.423 161，r=0.999 694；和厚朴酚Y=0.609 06X+4.51 683 9，r=0.999 526.
       2.2   快速萃取正交实验结果正交实验结果见表2，各因素对和厚朴酚提取的重要性为B＞D＞A＞C，对厚朴酚提取的重要性为B＞D＞C＞A，对总酚提取的重要性为B＞D＞A＞C；综合考虑，快速萃取的最优方法为：酒精度60%，提取3次，提取温度71℃，提取时间为10 min/次。
       a标准品HPLC图谱  b样品  1.和厚朴酚  2.厚朴酚
       图1  HPLC图谱（略）
       表2  正交实验结果表（略）
       2.3   优选提取方法的验证采用上述最优方法提取3次，厚朴酚、和厚朴酚以及总酚的提取率分别为94.59%，85.45%和88.81%，表明本方法的提取效果较好。
       2.4  精密度实验结果取厚朴酚以及和厚朴酚浓度为100 μg/ml 的对照品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算得厚朴酚与和厚朴酚的RSD分别为0.71% ，1.16% 。
       2.5   重复性实验取索氏提取的一个样品，依法平行测定5次，记录厚朴酚与和厚朴酚的色谱峰面积，计算得厚朴酚与和厚朴酚的RSD分别为0.91% ，1.23% 。
       2.6  稳定性实验取索氏提取的一个样品，每隔2   h进样1次，共进样5次，结果供试品溶液在10 h内稳定，厚朴酚与和厚朴酚的RSD分别为1.07%，1.32% 。
       2.7  回收率实验取已测知含量的样品5份，分别精密加入对照品适量，依RPHPLC法测定，结果见表3、表4，和厚朴酚的平均回收率为100.59%，RSD为1.13%；厚朴酚的平均回收率为99.34%，RSD为1.58%；本研究的RPHPLC测定法的回收率较好，方法是可行的。
       表3  和厚朴酚回收率（略）
       表4  厚朴酚回收率（略）
       3  讨论
       3.1  厚朴是一种应用较广的重要中药材，最近的研究表明，其中厚朴酚［4］与和厚朴酚［5］有抑制癌细胞的潜能，厚朴药材将会有更加广泛的医药用途；快速准确地提取及测定药材中的厚朴酚与和厚朴酚很有必要。本研究利用美国先进的快速萃取系统进行提取方法的研究，结果理想；但由于系统的萃取压力不可调，固定为1500 psi，因此正交实验中没有考察萃取压力因子的影响。
       3.2   本文的研究者考察了十多种测定厚朴皮的RPHPLC条件（结果另文报道），以本文报道的色谱条件最优，比《中国药典》2005年版介绍的方法理想；不仅分离效果、重复性、稳定性等指标理想，而且省时经济，测定一个样品只需13~15 min，《中国药典》2005年版介绍的方法则需要近35 min。
       　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005.
       ［2］  沈映君. 中药药理学［M］.上海：上海科学技术出版社,1997.
       ［3］  黄文华，郭宝林，斯金平. 不同种源厚朴酚性成分的HPLC图谱研究［J］. 中国中药杂志,2005,30(13)：968.
       ［4］  Lin ShyrYi, Liu JeanDean, Chang HuiChiu, et al.  Magnolol suppresses proliferation of cultured human colon and liver cancer cells by inhibiting DNA synthesis and activating apoptosis［J］.Journal of Cellular Biochemistry,2001,84(3)：532.
       ［5］  Xianhe Bai, Francesca Cerimele, Masuko UshioFukai, et al. Honokiol, a Small Molecular Weight Natural Product, Inhibits Angiogenesis in Vitro and Tumor Growth in Vivo［J］.  J. Biol. Chem, 2003, 278(37)：35501.
       (湖北民族学院生物技术研究所，湖北 恩施  445000；湖北省生物资源保护与利用重点实验室，湖北 恩施  445000；湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施  445000)