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       【关键词】  金丝桃苷；,,总黄酮；,,比色法；,,含量测定
       摘要：目的建立罗布麻叶Apocynum venetum L.总黄酮含量测定的适用方法。方法以金丝桃苷作为对照品采用不同的含量测定方法测定罗布麻叶中总黄酮含量。结果以金丝桃苷为对照品紫外分光光度法测定的结果最高（4.21%），以金丝桃苷为对照品三氯化铝显色法测定的结果次之（3.81%），而以金丝桃苷作为对照品亚硝酸钠硝酸铝-氢氧化钠络合比色法测定的结果最低（3.31%）。 结论 以金丝桃苷为对照品，在酸性（加入醋酸-醋酸钠缓冲液）条件下加入三氯化铝显色法后的测定方法为罗布麻叶总黄酮含量测定的适用方法。
       关键词：金丝桃苷；  总黄酮；  比色法；  含量测定
       罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetum L.的干燥叶，它是我国广泛应用的传统中药之一，在我国西北、华北及安徽的北部等很多地区均有其广泛资源。罗布麻植物有两个属三个种［1］：红麻属有罗布麻叶（Apocynum  venetum  L. 收载于2000年版《中国药典》为正品罗布麻叶）包括新疆小花罗布麻，白麻属有大花罗布麻叶Poacynum  hendersonni (Hook.f.) Wodson和紫斑罗布麻叶Poacynum  pictum (Schrenk) Baill。大量的药理实验证明，总黄酮是罗布麻叶中主要的有效部位之一，文献报道其总黄酮主要含有芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、黄芪豆苷、槲皮素、山奈酚等。新疆小花罗布麻中芦丁含量较高，而内地产的正品罗布麻叶、大花罗布麻叶、紫斑罗布麻叶中芦丁含量很少［2，3］。不同的含量测定方法测定罗布麻叶中总黄酮的含量不完全相同，而且有很大的差异。本文选择较有代表性的天津罗布麻叶，采用不同测定方法对其中总黄酮的含量进行测定和比较。
       　1  仪器与试剂
       6010型紫外可见分光光度计（安捷伦），BT 25 S型电子分析天平（德国赛多利斯）。罗布麻叶Apocynum venetum L.购于安徽亳州永刚中药饮片厂有限公司，经安徽中医学院生药教研室王德群教授鉴定为产于天津的正品罗布麻叶。金丝桃苷对照品（购自中国药品生物制品检定所   批号：1521200202），其他试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  以金丝桃苷为对照品紫外分光光度法测定［4］
       2.1.1  样品溶液与对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的天津罗布麻叶粗粉1.0 g，置索氏提取器中，加入100 ml甲醇提取5 h，蒸干甲醇后，再用甲醇溶解并定容于50 ml，过滤，续滤液则为样品溶液。另精密称取105℃减压干燥至恒重的金丝桃苷对照品3.993 mg，置于50 ml容量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。
       2.1.2  检测波长的选择精密吸取对照品溶液1.0 ml，样品溶液1.0 ml分别置于25 ml容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，以乙醇为空白对照溶液，在190~400 nm范围内扫描吸收曲线，样品与对照品的吸收曲线基本一致，它们在258 nm处有共同的最大吸收峰处有共同的最大吸收峰（见图1），因此我们采用258 nm作为测定波长。
       2.1.3  标准曲线的建立精密吸取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0与5.0 ml分别置于25 ml容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，以乙醇为空白对照溶液，照分光光度法（《中国药典》2005版Ⅰ部VB），在258 nm处测定吸收度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线。算得回归方程为A=5.105 9C-0.008 5 （r=0.999），在3.19~15.97 μg/ml的浓度范围内线形关系良好。
       2.1.4  精密度实验取1.0 ml对照品溶液置25容量瓶中，加乙醇定容至刻度，在258 nm处重复测定6次，得出其吸收值，算得RSD=0.9%。
       2.1.5  重复性实验称取天津产同批罗布麻叶药材粗粉6份，按样品溶液的制备方法制备样品，精密吸取1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，测定吸收值，算得RSD=0.77%。
       2.1.6  稳定性实验精密吸取同一份样品溶液，在1，2，3，4，5，6 h时分别测定吸收度，算得RSD=0.59%，结果表明样品溶液在6 h内基本稳定。
       2.1.7  回收率实验称取6份重现性试验用药材粗粉（总黄酮含量3.42%）适量，分别加入金丝桃苷对照品适量，同法提取、测定，计算得平均回收率为98.99%，RSD为1.97%。
       2.2  金丝桃苷作为对照品亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合比色法［5］
       2.2.1  样品溶液与对照品溶液的制备样品溶液的制备同2.1.1，另精密称取105℃减压干燥至恒重的金丝桃苷对照品11.107 mg，置于50 ml容量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。
       2.2.2  检测波长的选择精密吸取对照品溶液、样品溶液各3.0 ml分别置于25ml容量瓶中，加水至5.0 ml，显色：加5%NaNO2溶液1.0 ml，摇匀放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1.0 ml，摇匀放置6 min，加NaOH试液10.0 ml，加水定容，摇匀放置15 min；同时精密吸取对照品溶液、样品溶液各3.0 ml分别置于25 ml容量瓶中，加水至5.0 ml，各加NaOH试液10.0 ml，加水定容，摇匀，分别作为对照品、样品溶液各自的空白对照液，在波长400~700 nm范围内扫描，对照品和样品溶液的吸收曲线基本相同，均在(510±2) nm波长处有最大吸收（见图2），而空白对照吸收基本为0，故选510 nm为检测波长。
       2.2.3  标准曲线的建立精密吸取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0与5.0 ml分别置于25 ml容量瓶中，加水至5.0 ml，按上述方法显色，同时制备各自的空白对照溶液，放置15 min后于510 nm处测定吸收度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线。算得回归方程为A=15.992C-0.009 2（r=0.999），在8.885 6~44.428 μg/ml的浓度范围内线形关系良好。本测定方法的精密实验（0.93%）、 重现性实验（0.78%）、稳定性实验（1.21%）和回收率实验（1.69%）结果均符合规定。
       2.3   以金丝桃苷为对照品三氯化铝显色法测定［6］
       2.3.1  样品溶液与对照品溶液的制备样品溶液、对照品溶液的制备方法同2.2.1 。
       2.3.2  检测波长的选择参考文献中方法，样品液、对照品溶液分别加入醋酸-醋酸钠缓冲液，再加入AlCl3溶液显色，溶液呈黄色，扫描吸收曲线基本相同，最大吸收峰分别为400 nm和398 nm（见图3），我们选择398 nm作为测定波长。
       图1 （略）    
       图2 （略）
       图3  显色样品（线1）与对照品（线2）的吸收曲线（略）
       2.3.3  标准曲线的建立精密吸取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0与5.0 ml分别置于25 ml容量瓶中，加水至5.0 ml，准确加入醋酸-醋酸钠缓冲液（2  mol/L醋酸液：醋酸钠液=3∶1）5 ml和0.1 mol/L三氯化铝液3 ml，再加水定容至25 ml，摇匀，放置40 min，同时取水5 ml同法操作制备空白对照溶液，在398波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，算得回归方程按上述方法显色，同时制备各自的空白对照溶液，放置15 min后于510 nm处测定吸收度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线。算得回归方程为A=48.554C-0.003 9（r=0.999），在3.194 4~15.972 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。本测定方法的精密实验（0.69%）、 重现性实验（0.82%）、稳定性实验（0.71%）和回收率实验（1.71%）结果均符合规定。
       2.4  样品含量测定精密称取干燥至恒重的天津罗布麻叶粗粉1.0 g，置索氏提取器中，加入100 ml甲醇提取5 h，蒸干甲醇后，再用甲醇溶解并定容于50 ml，过滤，续滤液则为样品溶液。采用上述3种方法进行含量测定。结果如表1。
       表1   样品测定结果（略）
       　　3  讨论
       3.1    总黄酮含量测定的经典方法以芦丁为对照品比色法测定，但是正品罗布麻中芦丁的含量很少，因此用它作为对照品来进行含量测定不太适合。本文中采用了含量较高的金丝桃苷作为对照品比较合理。
       3.2   同一批罗布麻叶，采用3种含量测定方法测定其总黄酮的含量，结果相差较大：以金丝桃苷为对照品紫外分光光度法测定的结果最高（4.21%），以金丝桃苷为对照品三氯化铝显色法测定的结果次之（3.81%），而以金丝桃苷作为对照品亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合比色法结果最低（3.31%）。紫外分光光度测定的结果较高，是由于258 nm吸收波长是苯甲酰系统的紫外吸收产生的吸收波长，而自然界中具有苯甲酰系统的化合物较多，在258 nm处有吸收的化合物较多，如一些鞣质等，而一般黄酮类成分的药材中都含有鞣质，他们在258 nm处有很强的紫外，从而干扰总黄酮的含量测定的结果，最终导致测定结果偏高。
       3.3  黄酮类成分加入NaNO2，Al（NO3）3和NaOH试剂显色的反应原理是发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入NaNO2，Al（NO3）3和NaOH试剂时是不显色的，罗布麻叶总黄酮中有几个不具备该结构，如三叶豆苷、黄芪豆苷、三奈酚等。结果导致测定结果不准确（偏低）。
       3.4  三氯化铝显色法测定的原理为:在酸性环境下，黄酮醇母核中5位-OH、4位C=O与Al3+络合产生的络合物，在400 nm左右有最大吸收，且这个反应具有专属性。罗布麻叶黄酮类成分:芦丁、新异芦丁、异槲皮苷、金丝桃苷、三叶豆苷、黄芪豆苷、黄芪苷-6"-o-乙酸酯、异槲皮苷-6"-o-乙酸酯、槲皮素和山柰酚,其结构中均有5位-OH、4位C=O,故该法适合用于罗布麻叶总黄酮的含量测定。因此，罗布麻叶中总黄酮含量测定的适用方法为：以金丝桃苷为对照品，在酸性（加入醋酸-醋酸钠缓冲液）条件下加入三氯化铝显色后测定。
       参考文献：
       ［1］  Nihibe S, et al. Natural Medicines. 2001，55(1)：38.
       ［2］  载  斌. 大花罗布麻叶的生药鉴定［J］.中药材，1991，14（9）：19.
       ［3］  李  徽. HPLC法测定罗布麻叶中芦丁的含量［J］.《关于颁发乌鲁木齐市第六届自然科学优秀学术论文奖的通报》文号：乌政办［2002］58：41.
       ［4］  裴  瑾,万德光,李昌志.分光光度法测定金丝桃属药用植物总金丝桃素和总黄酮的含量［J］.成都中医药大学学报，2002,25(4)：43.
       ［5］  郭亚健,范  莉,王小强，等.关于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志，2002,22(2)：97.
       ［6］  傅丰永，章育中，尚天民，等.照山白片的生产工艺及质量标准［J］.药学通报，1980，15（8）：13.
       （安徽中医学院，安徽 合肥  230038；安徽医学科学研究所，安徽 合肥  230061）