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       【关键词】  银黄注射液；,,流感病毒鼠肺适应株；,,小鼠；,,MDCK细胞
       摘要：目的观察银黄注射液体内外抗流感病毒作用。方法用流感病毒鼠肺适应株（FM1）鼻腔滴入感染 BALB/C小鼠复制动物模型,记录小鼠存活时间,测定肺指数;用FM1感染的 MDCK细胞为实验系统，观察细胞病变程度,从而了解银黄注射液抗 FM1的药效。结果体外实验表明，先用药后感染病毒，银黄注射液0.11 mg・ml1以上可抑制 FM1对 MDCK细胞的病理损伤，先感染 FM1后用药，0.22 mg・ml1以上可抑制 FM1对 MDCK细胞的病理损伤；动物实验表明，银黄注射液肌注，小剂量仅使肺指数值降低(P＜0.05)，大中剂量明显降低肺指数(P＜0.01)及延长存活天数(P＜0.05)，静脉滴注小剂量仅使肺指数值降低(P＜0.05)，大中剂量明显降低肺指数、延长存活天数(P＜0. 01)。结论 体外实验，银黄注射液阻断 MDCK细胞感染 FM1作用强于对已感染该病毒的 MDCK细胞的保护作用；对FM1感染小鼠的保护作用，静脉滴注比肌注效果好，作用与病毒唑相当。 
       关键词：银黄注射液；  流感病毒鼠肺适应株；  小鼠；  MDCK细胞
       Experimental Studies on Anti-flu virus Effect of Yinhuang Injection in vivo and in vitro
       CHEN Mei-juan, GE Li, XIAO Shunhan, GU Li, LIU Jian
       (Department of Pharmacology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China; Department of Clinical Medicine, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou，646000 ,China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the anti-flu virus effects of Yinhuang injection in vitro and in vivo．MethodsBALB/C mite  nasal cavity and MDCK cells infected by FM1 were used as experimental models to record the survival time of mice,measure the pulmonary index and observe pathological changes of MDCK cells, so to evaluate the anti-flu virusl effects of Yinhuang injection．ResultsIn vitro: the pathological changes of MDCK cells which were given drugs firstly and infected by FM1 secondly decreased on dose of 0.11 mg/ml Yinhuang injection,but the pathological changes of MDCK cells which were infected by FM1 firstly and given drugs secondly decreased on dose of 0.22 mg/ml Yinhuang injection;  In vivo: the lung index decreased on small dose of Yinhuang injection by intramuscularly and intravenously (P＜0.05)，the lung index decreased and the survive time of mice extended obviosly on intravenous inject dose of 44,66mg/kg/d Yinhuang(P＜0. 01). ConclusionIn vitro, the effect of preventing FM1 infection is superior to the effect of protecting cells which have been infected by FM1. In vivo, the effect of Yinhuang by injecting intravenously is superior to that by intramuscularly, the effect of Yinhuang on a high dose is equal to that of Binduzuo.
       Key words：Yinhuang injection;   Flu virus;   mice;   MDCK cells
   
　　以金银花和黄芩提取物组成的银黄针、片、颗粒、胶囊及口服液等都已问世，并已收入中华人民共和国卫生部《中药成方制剂》第19册，由肌注增至静脉滴注［1］。银黄片剂、口服液、注射液的文献多为制剂、工艺研究，银黄片剂、口服液等药效研究报道甚少，未见银黄注射液药效实验研究报道。由我院药物研究所生产的银黄注射液，从生产工艺到质量标准，相继进行了一系列相关的实验研究，并在原质量标准基础上，增加薄层鉴别及 HPLC测定黄芩苷和绿原酸含量［2，3］，此次实验旨在了解本品体内外对 FM1的作用，为本品用于流感提供实验依据。
       　1  材料与仪器
       1.1  药物银黄注射液,50 ml/瓶，每毫升含绿原酸12.5 mg和黄芩苷20 mg，由泸州医学院药物研究所提供，批号：980511；病毒唑(阳性对照药)，0.1 g/ml，由焦作市康力药业股份有限公司生产， 批号： 980513。
       1.2  细胞与病毒 流感病毒鼠肺适应株（FM1）购自卫生部药品生物制品检定所；狗肾传代细胞株 (MDCK)购自中科院上海细胞生物学研究所。
       1.3  动物BALB/C小鼠，12～15 g幼龄鼠，由华西医学中心实验动物管理中心提供，Ⅱ级合格动物，合格证号：（1996）川实动质管第122号。
       1.4  仪器 RPMI1640培养液，谷氨酰胺，Hepes,胰酶，（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），细胞培养板（美国Corning），CO2孵箱（美国 ShelLab公司）。
       2  方法［4］
       2.1  体内抗FM1作用  实验小鼠感染 FM1 (100TCID50)后的 LD50=0.03 ml/只,鼻腔感染10 LD50 FM1后，第2天采用静脉滴注及肌注不同浓度的银黄注射液，1次/d，连续注射药物6 d，共观察2周，记录小鼠的生存天数及测定肺指数。实验设病毒对照组和溶剂对照组（0.85%生理盐水）。
       2.2  体外抗 FM1作用  ①药物对 FM1增殖的抑制作用：在96孔培养板的MDCK单层细胞内，每孔感染FM1 100TCID50，2 h后倾去病毒液，分别加入不同浓度的银黄注射液，培养96 h后观察细胞病变。②药物对 FM1感染细胞的阻断作用：每孔先上不同浓度的银黄注射液，2 h后倾去药液，每孔加入 FM 1100TCID50，培养96 h后观察细胞病变。
       2.3  统计方法 资料应用 SPSS11.0 统计软件包单因素方差分析 SNK法统计,所有数据用±s表示。
       　3  结果
       3.1  体内抗 FM1作用   见表1。
       表1  银黄液对感染 FM1 (10LD50)小鼠的保护作用（略）
       与病毒对照组比较, **P＜0.01, *P＜0.05；n=10
   
　　由表1可见, 肌注和静注银黄液，小剂量仅使肺指数值降低(P＜0.05)，大中剂量明显降低肺指数(P＜0.01)，肌注银黄液，大中剂量延长存活天数 (P＜0.05)，静注银黄液及病毒唑则显著延长存活天数 (P＜0.01)。
       3.2  体外抗 FM1作用从表2~3可见,先上银黄注射液作用 MDCK细胞,0.11 mg/ml可抑制 FM1的病理损伤;先上 FM1感染 MDCK细胞,再上药液,0.22 mg/ml以上才能抑制细胞病理损伤，病毒唑0.25 mg/ml以上能抑制细胞病理损伤。 
       4  讨论
       流感病毒是流感的病原体,流感是高传染性的季节性流行疾病，每年有10％~20％的全球人口感染流感病毒。由于病毒的变异性强，使治疗成为难题，疫苗的研制和生产相对滞后，对于易感人群的保护率不高，因此，新的流感大流行随时都有可能爆发。在这种情况下，寻找具有预防和治疗作用的抗流感药物就显得尤为重要和紧迫。目前上市西药主要有M2离子通道阻断剂金刚烷胺，但其副作用常见，如精神错乱、失眠等，易产生耐药性，使其使用受到限制；神经氨酸酶抑制剂扎那米韦剂型服用受限，易出现暂时性喘鸣，或使有高敏性呼吸道疾病患者的肺功能降低，且因证据不足以下结论及研究对象数量有限，还无法作为治疗流感的常规用药［5］。
       表2  银黄注射液作用于 MDCK细胞2 h后再感染 FM1100TCID50（略）
       --无细胞病变;+25%细胞病变;++50%细胞病变; +++75%细胞病变;++++100%细胞病变
       我国中草药资源丰富，从古至今用中医药治疗流感疗效显著，中医药防治流感有着广阔的前景。有实验研究表明黄芩提取物中的黄酮类化合物能抑制流感病毒感染小鼠的病毒增殖, 以金银花为君药的银翘散有体内外抗流感病毒作用［6］，但尚未见银黄注射液抗 FM1的实验研究报道，故而本实验选取 FM1滴鼻感染 BALB/C小鼠及 FM1感染的 MDCK细胞为实验系统，观察银黄注射液抗 FM1的药效，结果表明, 体外银黄注射液阻断 MDCK细胞感染 FM1作用强于对已感染该病毒的 MDCK细胞的保护作用；对 FM1感染小鼠的保护作用，静脉滴注比肌注效果好，作用与病毒唑相当。
       　参考文献：
       ［1］  中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准・中药成方制剂，第19册［S］.北京：中国药品标准杂志社，1998：197.
       ［2］  邱华荣，胡帮华，刘仲义.银黄注射液质量标准的改进［J］.中成药，1999，21（11）：570.
       ［3］  税丕先，田  吉.高效液相色谱法测定银黄注射液中绿原酸的含量［J］.中国药业，2004，14（8）：56.
       ［4］  Huang J .X. Medical Viral-base And Experimental Technology(医学病毒学基础及实验技术) ［M］.Beijin: Science Publishing Company,1990.
       ［5］  Lin QIAO.Antiviral therapeutics on flu. Foreign Medical Scie-Section,on,Pharmacy (国外医学-药学分册)，2005,32(3):192.
       ［6］  肖涪仁，吴红娟，郭  宇，等.银翘散对细菌和病毒的药效学对比研究［J］.湖南中医学院学报,2003，23(1)：15.
       （泸州医学院，四川 泸州  646000；泸州医学院，四川 泸州  646000）