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       【关键词】  银翘散；,,指纹图谱；,,高效液相色谱
       摘要：目的建立银翘散的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法采用梯度洗脱法对银翘散进行HPLC测定，流动相为0.05％磷酸-甲醇梯度洗脱，流速为0.8 ml・min-1，检测波长为279 nm。结果运用梯度洗脱能较好的分离银翘散水煎提取物的主要成分；经方法学考察，HPLC指纹图谱具有良好的重现性：10个不同地区的样品中18个特征指纹峰有专属性。结论建立的银翘散HPLC指纹图谱分析法为银翘散及其制剂的质量的评价奠定了基础。
       关键词：银翘散；  指纹图谱；  高效液相色谱
       Fingerprint Chromatography of YinQiaosan by HPLC
       JIANG Xia, HE Zaian, LIU Yanwen*
       (Hubei Key Laboratory of Resource Science and Chemistry in Chinese Medicine,Traditional Chinese Medical College of Hubei, Wuhan, 430061)
       Abstract:ObjectiveTo establish the HPLC-FPC of YinQiaosan.MethodsThe gradient elution was adopted elution with methanol and-0.05％phoshoric acid, the flow rate was 0.8 ml・min-1,and the detection wavelength was at 279 nm.ResultsThe constituents of YinQiaosan were well separated on HPLC and the HPLC-FPC of 10 batches of samples was established. The results showed that this method had a good repeatability and the 18 common peaks had an exclusive properties. ConclusionThe method developed can supply the foundation for the quality evaluation of YinQiaosan and relative substance conveniently.
       Key words:YinQiaosan;  Fingerprint chromatographyc;  HPLC
   
　　银翘散是治疗风热感冒的常用方，由金银花、连翘、薄荷、桔梗、牛蒡子、淡竹叶、荆芥、淡豆豉、甘草组成。具有辛凉解表、清热解毒的功效。笔者从7个省10个城市不同药店购买了银翘散。这些不同地区药材组方的HPLC指纹图谱是否包括有银翘散成分群信息的存在，并能通过这些信息，了解其内在质量，并为动物体内实验提供充分依据。对此我们进行了实验研究。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器与试剂DionexP680型高效液相色谱仪（德国戴安），Tcc-100柱温箱，UVD-170U紫外检测器，Mettler Toledo AT20型分析天平（十万分之一），所用试剂均为分析纯。
       1.2  药材来源银翘散复方购于山西大同(1)、山东潍坊(2)、山西临汾(3)、陕西西安(4)、湖北随州(5)、湖北武汉(6)、湖南湘潭(7)、广东江门(8)、山东莱芜(9)、河南郑州（10），绿原酸（110753-200212）、原儿茶酸、牛蒡子苷（110819-200404）、连翘苷（110821-200406）均购于中国药品生物制品检验所。
       　2  方法
       2.1  色谱条件色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇（A）-0.05%磷酸（B）0~10 min甲醇由10％升到20％,10~30 min甲醇由20％升到35％,30~50 min甲醇由35％升到37％,50~80 min甲醇由37％升到50％；流速0.8 ml・min-1；检测波长279 nm；柱温30℃；分析时间80 min。
       2.2  供试品的制备取金银花10 g，连翘10 g，薄荷6 g，桔梗6 g，牛蒡子6 g，淡竹叶4 g，荆芥4 g，淡豆豉5 g，甘草5 g，加10倍量的水，回流提取1 h，倾出煎液，药渣再加入8倍量的水提取30 min，合并煎液，浓缩成相当于生药量1 g・ml-1的溶液后加入乙醇配成70%的乙醇液，过夜，滤过，回收乙醇，移置100 ml量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液，从储备液中吸取2   ml，用甲醇定容到10 ml，经0.2 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
       2.3  对照品的制备精密称取原儿茶酸、绿原酸、牛蒡子苷、连翘苷适量，用甲醇溶解，并稀释成一定浓度的各对照品溶液。
       2.4  指纹图谱及技术参数
       2.4.1  指纹图谱的制备精密吸取10批银翘散供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件操作，考察120 min供试品溶液的色谱分离情况，记录80 min色谱图。即得。结果见图1。
       图1  10个地区的银翘散指纹图谱叠加图（略）
       2.4.2  共有指纹峰的标定根据10批银翘散供试品的检测结果，比较其色谱图。以相对保留时间标定其共有指纹峰18个，以4号峰为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间，结果RSD均小于3%。结果见表1。
       2.4.3  共有指纹峰面积的比值根据10批银翘散供试品的色谱图结果，以参照峰的峰面积为1，计算各共有指纹峰面积与参照峰面积的比值及平均比值。结果见表2。
       2.4.4  非共有峰峰面积的比值计算非共有峰占总面积的比值，结果表明，其比值小于10%，符合指纹图谱的要求。结果见表3。
       表1  共有峰相对保留时间（略）
       表2  共有峰相对面积（略）
       表3  非共有峰总面积所占比例（略）
       2.4.5  共有峰的归属精密吸取原儿茶酸、绿原酸、牛蒡子苷、连翘苷分别进样，对照相对保留时间可知，指纹谱中2号峰为原儿茶酸，3号峰为绿原酸，16号峰为牛蒡子苷，17号峰为连翘苷。见图2。
       图2  银翘散中成分分析及峰指认（略）
       2.5  方法学考察为了考察分析方法的可靠性，以样品5为例，对仪器的精密度、方法重现性以及稳定性做了相应的考察。
       2.5.1  精密度实验取同一供试品溶液，连续进样6次，其共有峰保留时间RSD均小于3%，峰面积占总峰面积10%以上的共有峰峰面积的RSD不超过10%，表明进样的精密度良好。见表4~5。
       2.5.2  重复性实验取5号银翘散配方5份，分别按供试品溶液制备方法制备，分别进样，检测指纹峰，其共有峰相对保留时间的RSD小于3%，10以上的共有峰峰面积的RSD不超过10%，表明进样的重复性良好。结果见表6~7。
       表4  精密度及稳定性实验（相对保留时间）共有峰（略）
       表5  精密度及稳定性实验（相对峰面积）共有峰（略）
       2.5.3  稳定性实验由于样品每次进样需要运行时间接近2 h，故精密度实验和稳定性实验可以同时考察。结果见表4~5。
       　3  讨论
       3.1  根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》［1］制定了银翘散的指纹图谱，取得了较满意的研究结果。
       3.2  本研究对甲醇水、乙腈水、甲醇磷酸、乙腈磷酸等流动相系统进行了比较，结果表明甲醇-0.05%磷酸系统最好。实验过程中比较了UV和ELSD两种检测方法，并在200～400 nm之间选择波长，结果以紫外279 nm效果最佳。按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》一般记录1 h的图谱，本实验制定指纹图谱记录80，120 min以后不出现峰，符合要求。
       表6  重复性实验（相对保留时间）共有峰（略）
       表7  重复性实验（相对峰面积）共有峰（略）
       3.3  中药复方其成分复杂，采用定性鉴别和指标成分的含量测定方法很难反映其内在质量，而对其进行指纹图谱测定，可提供多成分群信息。本研究为银翘散及其制剂的质量评价提供了科学依据。也为下一步动物体内实验的研究奠定了基础。其体内实验结果后续报道。
       　参考文献：
       ［1］  国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）［S］.中成药,2000，22（10）：671.
       (湖北中医学院中药资源和中药化学重点实验室，湖北 武汉  430061)