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       【关键词】  何首乌；,,DNA提取；,,AFLP
       摘要：目的为获得高质量的何首乌总基因组DNA。方法采用CTAB法提取，对其提取方法进行改进。结果用改进的方法提取的样品DNA的OD260/OD280值在1.630~1.955之间，琼脂糖凝胶上主带清晰、降解较少，能完全被限制性内切酶EcoR Ⅰ和MseⅠ完全酶切，得到合适的AFLP指纹样式。结论 改良的CTAB法提示提取何首乌DNA的理想方法，适合AFLP-PCR反应和其他分子生物学应用。
       关键词：何首乌；  DNA提取；  AFLP
       Genomic DNA Extraction from the Polygonum multiflorum Thunb.
       YAN Ping, ZHAO ShuJin*
       (Biological Science Engineering College of South China University of Technology   Guangzhou  510640，China; Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou  510010,China)
       Abstract：ObjectiveTo isolate high-quality genomic DNA from Polygonum multiflorum Thunb.MethodsCTAB isolation method was used and modified in this paper.ResultsUsing the modified CTAB methods, the value of OD260/OD280 of DNAs were between 1.630 and 1.955. Strips were clear and less decomposed in agarose electrophoresis. The DNAs were completedly digested with restriction endonucleases and amplified by the polymerase chain reaction(PCR). Sharp fingerprint patterns of AFLP were obtained.ConclusionThe improved CTAB method was optimal for analysis of AFLP-PCR and other molecular biology research.
       Key words：Polygonum multiflorum Thunb.;   DNA isolation;  Amplified fragment length polymorphism
   
　　何首乌系多年生落叶草本植物，始载于《开宝本草》，又名乌肝石、赤首乌石、夜交藤,是蓼科Polygonaceae植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的块根,具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨之功效,是滋补肝肾常用中药之一。产陕西南部、甘肃南部、华东、华中、华南、四川、云南及贵州，几乎遍及全国。生山谷灌丛、山坡林下、沟边石隙，海拔200~3 000 m［1］。中药产地不同、品种不同，其成分、功效及药用品质就有很大的差异［2］。因此，准确鉴定何首乌品种是保证临床用药安全有效的前提。DNA分子标记技术的出现引起了人们的高度重视，目前已广泛应用于在中药的鉴定上。植物细胞除了具有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂类、色素和酚类等次生物质，给基因组DNA的提取和纯化带来很多的困难，因此如何从中提取到高纯度的基因组DNA用于分子遗传分析是个关键的问题。由于不同的植物所含的次生物质不一样，因此，对不同的植物采取不同的DNA提取方法，以保证DNA的质量［2］。本文采用了改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA，探讨提取效果，并将各种方法提取的DNA用于AFLP扩增，从而筛选出适合于AFLP扩增的何首乌基因组DNA的提取方法。
       　1  器材与方法
       1.1  材料何首乌叶片采自广东德庆县德城镇，经华南植物园邢富武教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于－20℃冰箱备用。
       1.2   仪器Sigma 1-15K Centrifuge，Beckmen DU-530紫外分光光度计，GeneAmp PCR Systerm 2400(PERKIN ELMER)，水浴锅，研钵等。
       1.3   试剂CTAB、尿素、Tris碱、EDTA、PVP40、RnaseA、β-巯基乙醇等购于北京鼎国生物公司（geneview进口分装），Primer由上海生物工程有限公司合成，dNTP、Taq聚合酶、T4连接酶购自Takara宝生物（大连）有限公司,EcoR Ⅰ&MseⅠ购自New England Biolabs。
       1.4  样品DNA提取方法
       1.4.1  CTAB法该方法参照邹喻萍等［3］的方法。将何首乌干叶片研成粉末,称取0.05 g硅胶干燥粉末置于液氮中速冻30 s，再迅速研磨使呈糊状或粉状，将糊状或粉状物转入2.0 ml eppendorf管中,加入1 ml 2%CTAB抽提缓冲液65℃保温45～60min, (2%CTAB抽提缓冲液：2%CTAB ，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl, 2%巯基乙醇),期间轻缓颠倒摇动数次；取出eppendorf管，使之恢复室温，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提,轻缓颠倒混匀,室温下12 000 r/min离心10 min，吸取上清液；再加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)重复抽提1次,离心后吸取上清液加入2/3体积预冷异丙醇,混匀,-20℃下放置30 min或过夜,4 000 r/min离心10 min,小心去上清液,用70%乙醇洗涤1次,溶于200 μl 0.1TE（1.0 mmol/ Tris－HCl pH 8.0，0.1 mmolEDTA pH8.0）中,加入3～5 μl RNaseA储备液（10 mg/ml），在37℃保温1h以裂解RNA；保温后用等体积氯仿-异戊醇(24∶1)再抽提1次，将水相转入另一1.5 mleppendorf管，加入1/5体积10 mol/LNH4Ac（使其终浓度为2 mol/L），然后加入2体积冰冷的95％乙醇，在-20℃放置至少30 min；在10 000 g离心10 min，收集沉淀，分别加入70%和90%乙醇去除残留的无机离子，在室温下自然风干直至沉淀无乙醇味，视沉淀的多少而溶入适量的0.1 TE缓冲液，分装后放入－20℃储存或放入4℃待用。
       1.4.2   改进CTAB法该方法参见Doyle等［4］和陈大明等［5］的方法。将何首乌干叶片研成粉末,称取0.1g硅胶干燥粉末置于液氮中速冻30 s，再迅速研磨使呈糊状或粉状，将糊状或粉状物转入2.0 ml eppendorf管中,加入1 ml CTAB抽提缓冲液65℃保温45～60 min,期间轻缓颠倒摇动数次；取出eppendorf管，使之恢复室温，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提,轻缓颠倒混匀,室温下12 000 r/min离心10 min；吸取上清液,加入1/10体积的10%CTAB溶液(10%CTAB， 0.7 mol/L NaCl),再加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)重复抽提1次,重复氯仿-异戊醇抽提，轻缓颠倒混匀,室温下12 000 r/min离心10 min；吸取上清,加入2/3体积预冷异丙醇,混匀, -20℃下放置30 min以上,4 000 r/min离心,去上清后分别用70%乙醇和无水乙醇各洗涤1次, 室温吹干后溶于200 μl TE中, 然后用RNaseA酶于37℃处理1 h，上清液移入新的离心管中,加入1/10体积的3 mol/L NaCl(pH 5.2)溶液,混匀后加入2倍体积的冰冷的100%乙醇,颠倒混匀,-20℃放置50 min，DNA形成絮状沉淀。钩出DNA絮团,在70%乙醇中漂洗, 分别加入70％和90%乙醇去除残留的无机离子，在室温下自然风干直至沉淀无乙醇味，视沉淀的多少而溶入适量的0.1TE缓冲液，分装后放入－20℃储存或放入4℃待用。根据改进的CTAB法，对CTAB抽提缓冲液进行了调整如下:CTAB抽提缓冲液设置了1%，2%，3%，4%CTAB 4个浓度梯度，只改变CTAB的浓度, 其余0.5%巯基乙醇, 100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/LNaCl不变。对2%CTAB抽提缓冲液进行了改进： 2%CTAB，2%PVP, 100mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 20 mmol/LEDTA,1.4 mol/L NaCl。    对2%CTAB抽提缓冲液进行了改进：2%CTAB，2%PVP, 2.0%巯基乙醇,100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl。对2%CTAB抽提缓冲液进行了改进：2%CTAB ，2%PVP, 0.5%巯基乙醇,100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl。
       1.5   DNA质量检测
       1.5.1  紫外吸收与琼脂糖凝胶电泳检测对提取的DNA样品作适当稀释后, 用Beckmen DU-530紫外分光光度计测定样品DNA浓度与质量(OD值)。以0.8%琼脂糖凝胶检测DNA主带质量：5 μl DNA样品+2 μl溴酚蓝上样缓冲液,加样于含溴化乙锭(EB)的凝胶上于3V/cm，电压下电泳0.6 h,于紫外灯下观察，记录，拍照。
       1.5.2   限制性内切酶酶切检测将提取的DNA用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ于37℃水浴中酶切消化5 h后(酶切反应总体积为20  μl，包括10×NEBuffer 2 μl，100×BSA 0.2 μl，DNA 400 ng，EcoRⅠ5U， MseⅠ5U，加超纯水至20 μl)，用1.0%琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭)电泳检测酶切程度。
       1.5.3   PCR扩增检测双酶切连接与预扩增模板DNA制备：本实验采用EcoRⅠ和MseⅠ双酶切目的DNA,然后用T4DNA连接酶，将EcoRⅠ和MseⅠ接头与酶切片段连接起来，构建成预扩增模板DNA，37℃温育过夜(8 h)，进行下一步反应,或-20℃贮存。预扩：选择性扩增模板DNA制备亦即预扩增,采用表1体系。PCR扩增程序：94℃2 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，30个循环;4℃保存。预扩产物用ddH2O稀释20倍待用，4℃保存。预扩产物可在1%Agarose胶上检测，3V/cm电泳30 min。选择性扩增选择性扩增体系见表1,扩增程序:95℃2 min，95℃20 s,65℃30 s(每个循环降低0.7℃),72℃60 s, 12个循环；94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，30个循环；4℃保存。
       表1  AFLP反应体系（略）
       选扩产物可在聚丙烯酰胺胶上检测,80W恒功率电泳100 min。
       　2  结果与分析
       2.1  不同方法对何首乌基因组DNA提取的纯度紫外检测影响采用了上述8种方法提取何首乌基因组DNA，BackmanDU-560测定样品DNA浓度与质量，所得DNA的OD260/OD280如表2。结果表明,8种方法提取的DNA,其OD260/OD280平均值为1.630~1.995，多次重复的结果很接近。这表明2%CTAB法提取的DNA均有较好的纯度,且结果都比较稳定。
       表2  不同方法提取DNA OD260/OD280值方法（略）
       2.2  基因组的电泳检测图1中泳道1~8为采用以上8种方法提取的何首乌的总DNA电泳图谱。从电泳图谱可以看出，所提取的DAN 在凝胶上呈较整齐的一条线, 主谱带清晰无严重的拖带现象, 无明显DNA带,表明该DNA样品质量较好,说明该8种方法提取的DNA降解现象均较轻,完整性较好。但在电泳过程的观察中发现,用经典CTAB法和4%CTAB法提取的DNA的点样孔比较亮,这有可能与该法提取的DNA杂质含量高,尤其是多糖,它与DNA不可逆的结合及不易分离有关。
       图1  不同方法提取的何首乌总DNA电泳图（略）  
       图2  不同方法提取的何首乌总DNA双酶切电泳图（略）
       2.3  双酶切检验图2为利用不同方法提取何首乌基因组DNA的EcoRⅠ和MseⅠ酶切图谱，从图中可看出不同方法提取的基因组DNA酶切效果均较好,在凝胶上呈现出连续的大小不同的DNA片段，说明提取的DNA纯度好，适合进行下一步分子生物学的分析。
       2.4   AFLP的预扩检验图3可以看出DNA片断分布范围在100～1000 bp左右，扩增信号较强，无明显带的出现，为随后进行的选择性扩增提供了理想的模板。
       2.5  选扩图4为预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增，经聚丙烯酰胺胶高压电泳后银染得到清晰的条带结果，说明用提取的DNA符合进行AFLP分子标记实验的要求，也符合一般分子生物学实验的要求。
       图3  不同方法提取何首乌基因组AFLP检测的预扩（略）
       图4  不同方法提取何首乌基因组AFLP检测的选扩（略）
       　3  讨论
       基因组DNA的有效提取是进行任何DNA下游工作的前提和基础，有效提取指的是得到的基因组DNA有足够的量、尽可能少的降解和不含有影响下一步酶反应的杂质［6］。因为不同植物的结构和次生物质成分不同，而致结构和次生物质的差异对DNA的不同提取方法往往会造成不同程度的影响，导致了不同方法所得DNA在得率和质量上得差异。提取过程中许多步骤对基因组DNA的提取影响非常大，首先是样品的充分研磨，该步骤与DNA的得率相关性极大；而且在液氮中研磨后的样品要迅速转移加入裂解液，主要是防止细胞破碎后释放的一些次级代谢物发生氧化作用和DNA降解。其次是提取方法的改进。CTAB是一种去污剂，它可与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7 mol/L NaCl）中可溶并且稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3 mol/L NaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白质极多糖仍溶于溶液中［6］。何首乌不同地方的品种其总DNA提取的难易程度不同。但其多糖物质较多，在用没改进CTAB法提取得到的样品中大部分琼脂糖电泳后胶孔处比较亮(有EB的吸收)，提取液常比较粘稠，多糖与DNA共沉淀而使沉淀物呈胶冻状。这对进行DNA的酶切影响非常大，以致很多DNA不能被内切酶酶解。在对提取方法改进后，在提取过程中用10%的CTAB进行去多糖，得到了明显的改善；但在对多糖较少的一些样品添加10%CTAB时，会大大降低DNA的得率，所以在操作过程中10%CTAB的添加和添加的次数要慎重。本研究采用改进得CTAB进行何首乌总基因组DNA的提取，获得了高质量的DNA，适合下一步的分子生物学的研究。
       参考文献：
       ［1］  中国科学院中国植物志委员会.植物志 ［M］.北京：科学出版社，1998：96.
       ［2］  徐  虹，章  军，郑  敏，等. 中药肉桂基因组DNA的提取［J］.中药材,2004, 27（5）：326.
       ［3］  邹喻萍，葛  颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京：科学出版社，2001：16.
       ［4］  Doyle JJ, Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］.Phytochemistry Bulletin, 1987, 19：11.
       ［5］  陈大明，张上隆，金勇丰.一种木本果树基因组DNA提取方法研究［J］.1997, 23(6)： 621.
       ［6］  邵鹏柱，曹  晖.中药分子鉴定［M］.上海：复旦大学出版社，2004：49.
       (华南理工大学生物科学与工程学院，广东  广州  510640；中国人民解放军广州军区广州总医院，广东 广州  510010)