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       【关键词】  贝类多糖；,,提取；,,正交实验
       摘要：目的优选淡水贝类多糖的最佳提取工艺。方法采用水提法，以多糖含量为指标，利用正交实验法对提取过程中的醇沉浓度、浸提温度、浸提比及浸提时间4个因素进行优选研究。结果最佳提取条件为：加无水乙醇至醇沉浓度为75%，浸提温度60℃，浸提比1∶2，浸提时间6 h。结论 优化的淡水贝类水提醇沉工艺简便，合理，可行。
       关键词：贝类多糖；  提取；  正交实验
       Study on the Optimum Extraction Process of Shellfish Polysaccharide
       LIU Xiao-yan，  LI Chaopin*，ZHAN Xiaodong
       (School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, Huainan, Anhui, 232001，China)
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of shellfish polysaccharide. MethodsTaking the content of polysaccharide as an index, four technological factors of water extraction process, ie, alcohol strength, extraction temperature, water volume used and extraction time were optimized by orthogonal test. ResultsThe ideal extraction process was as follows: dehydrated alcohol was added to the fluid until the alcohol content up to 75%; extraction with 60 ℃; extraction with water for two times; each extraction running 6 hours. ConclusionThe optimum extracting procedure simple, reasonable and reliable.
       Key words：Shellfish polysaccharide;   Extraction;   Orthogonal test
   
　　贝类属软体动物门，目前全世界的现生种类约有108 000种，根据它们栖息环境不同分为海洋贝类、淡水贝类和陆生贝类［1］。本文对淡水贝类如河蚌，田螺等的多糖提取工艺进行了较为系统的研究，初步探讨出了一条较为理想的提取工艺。本文主要以中国圆田螺为例报道研究结果。中国圆田螺Cipangopaludina chinensis属软体动物门（Phylum Mollusca），腹足纲（Gastropoda），前鳃亚纲（Prosobranchia），中腹足目（Mesogastropoda），田螺科（Viviparidae），圆田螺属(Cipangopaludina Hannibal)。《本草纲目》记载“田螺利湿清热，止渴醒酒，利大小便；治脚气、黄疸”。民间根据田螺有“清湿热、利小便”等之作用，常应用于治疗小便不畅、黄疸、中耳炎、痔疮等症。近年，有关贝类多糖的研究证实其具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖等多种生物学活性［2］，引起了学术界关注。贝类多糖的提取方法通常有水提法、碱提法和酶提法［3］，但是各种方法提取的最佳条件尚有待探讨。本实验采用水提法提取，进行了醇沉浓度、浸提温度、浸提比及浸提时间四因素三水平的正交实验，以找出一种最佳的提取方案，为进一步研究贝类多糖活性奠定基础。
       　1  器材
       1.1   原料中国圆田螺，当地采集。
       1.2   仪器和试剂无水乙醇（蚌埠化学试剂厂，AR），丙酮（江苏省宜兴市展望化工试剂厂，AR），高速组织捣碎机（上海标本模型厂），高速离心机，恒温磁力搅拌器(国华电器有限公司)， DZF6030A真空干燥箱（上海一恒科技有限公司），721分光光度计。
       2   方法与结果
       2.1   影响淡水贝类多糖提取主要因素的选择根据文献报道，影响水浸提多糖的因素主要有醇沉浓度、浸提温度、浸提比、浸提时间等，本实验对醇沉浓度、浸提温度、浸提比、浸提时间等因素采用正交实验法进行优选。因素水平设计见表1。选用L9(34)正交表，实验安排见表2。
       2.2  正交实验设计取中国圆田螺9份，清洗去壳每份取螺肉200 g，匀浆过滤后按正交方案（表2）进行水提、醇沉，沉淀分别用适量无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤去脂后干燥。
       表1  淡水贝类多糖提取的因素水平（略）
       2.3   淡水贝类粗多糖含量测定以葡萄糖为标准品，采用苯酚－硫酸法测定淡水贝类粗多糖的多糖含量［4］。
       2.3.1   总糖含量标准曲线的绘制精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖约60 mg，置100 ml量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.1，1.5，2.0，2.5，3.0 ml分别置于50 ml容量瓶中，加蒸馏水定容。精密移取上述溶液各2 ml，然后分别加入 5%苯酚1ml，摇匀后迅速加入浓硫酸7 ml，5 min后置沸水浴中加热30 min，取出置冷水中冷却。用分光光度计在波长490 nm处测定吸光度A。以A值对浓度C绘制标准曲线，进行线性回归，得标准曲线方程：A= 0.054 5+0.024 2C，r=0.999 5。
       2.3.2   精密度实验精密移取葡萄糖标准溶液2 ml，共5份，按标准曲线项下方法操作测得平均吸光度为0.284 5，相对标准差（RSD ）为2.62%，结果表明精密度符合要求。
       2.3.3   稳定性实验精密移取样品液，按标准曲线项下方法操作，每10 min 测 1 次吸光度，到1 h后改为30 min 测1次，120 min 内测490 nm处测定吸光度8次得出RSD为2.43%，结果表明测定值在120 min 内保持稳定。以下吸光度的测定均在120 min 内完成。
       2.3.4   供试液总糖含量测定精密量取淡水贝类粗多糖10 mg置10 ml容量瓶中加蒸馏水稀释至刻度得供试液。取供试液各2 ml，按“总糖含量标准曲线”项下操作，测定A值并代入回归方程计算多糖含量。
       2.4   实验结果及方差分析结果结果见表2~3。
       表2   正交实验的设计与结果（略）
       表3  正交实验方差分析（略）
       由表2直观分析影响淡水贝类多糖提取因素的主次顺序为A＞B＞C＞D；从表3的方差分析可见A因素各水平之间有极显著性差异，B因素各水平之间有显著性差异，C因素对多糖含量也有一定影响。综合考虑最佳工艺为A2B2C1D1，即醇沉浓度75%，浸提温度60℃，浸提比1∶2，浸提时间6 h。
       2.5   优选工艺的验证实验按优选的工艺进行验证实验，测得粗品中多糖含量平均值为 65.85%，RSD为1.25%，结果表明该工艺稳定可行。
       3  讨论
       水提法是动物多糖提取最原始的方法，该方法较其他方法温和，简单，经济。本实验通过正交实验证实了该法的最佳提取条件为醇沉浓度75%，浸提温度60℃，浸提比1∶2，浸提时间6 h。而且通过验证该工艺稳定可行，为进一步研究贝类多糖的成分结构及生物活性奠定了基础。
       　　参考文献：
       ［1］  刘月英，张文珍，王耀先.医学贝类学，第1版［M］.北京：海洋出版社出版，1993：1.
       ［2］  殷涌光，韩玉珠，丁宏伟.动物多糖的研究进展［J］.食品科学，2006，27（3）：256.
       ［3］  范秀萍，吴红棉.氨基多糖的研究方法［J］.湛江海洋大学学报，2002，22（6）：73.
       ［4］  董  群，郑丽伊，方积年.改良的苯酚－硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究［J］.中国药学杂志，1996，31（9）：550.
       (安徽理工大学医学院， 安徽  淮南  232001)