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       【摘要】 
       目的观察并比较半夏蛋白对体外培养的人肝癌细胞Bel7402的生长抑制作用。方法应用流式细胞技术，检测半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用，并观察了其诱导凋亡作用的量效关系。结果60%硫酸铵沉淀蛋白没有明显诱导Bel7402细胞凋亡的作用，而30%硫酸铵沉淀蛋白有诱导Bel7402细胞凋亡的作用。30%沉淀进一步分离结果显示，只有0.1 mol/L NaCl洗脱峰有一定诱导Bel7402细胞凋亡的作用。结论半夏蛋白有一定的诱导Bel7402细胞凋亡作用，其主要成分可能存在于总有机酸部位。
       【关键词】  半夏提取物； 人肝癌细胞Bel7402； 细胞凋亡
       
       Experimental Study on Inducing Apoptosis Effects of Pinellia ternate Protein on Human Hepatoma Cell Line Bel7402
       HUANG Bisheng
       
       Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan, Hubei 430065, China
       Abstract：ObjectiveTo study the inducing apoptosis effects of Pinellia ternate protein on human hepatoma cell line bel7402. MethodsFlow cytometry was used to test the effects of Pinellia ternate proteins. The dosageeffect relationship was also studied. ResultsThe 60% (NH4)2SO4 depository protein showed no significant inducing apoptosis effects, while the 30% depository protein showed some effects, and 0.1 mol/L NaCl depository protein form 30% (NH4)2SO4 deposition also showed some effects. Conclusion The Pinellia ternate protein has some effects of inducing apoptosis of Bel7402, and probably the total organic acid is the main inducing apoptosis parts.
       Key words：Pinellia ternate protein;  Human hepatoma cell line Bel7402;  Apoptosis
        半夏临床上可单独或与其它药物配伍用于治疗食管癌、卵巢癌及肝癌等。近年来对抗癌中药的研究发现，其作用途径主要是通过杀伤癌细胞、抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、调节机体免疫功能来实现的［1］。研究也发现，半夏乙醇提取液、半夏总有机酸、掌叶半夏蛋白分别对肝癌细胞（HepG2）、胃癌细胞及卵巢癌细胞具有抑制作用［2～4］。然而不同产地半夏及其类似品所含的蛋白抗癌作用有何差异，目前尚未见相关报道。本文拟采用不同提取方法，观察并比较不同产地的半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用。
       1  器材与试剂
       1.1  药物来源半夏鲜品采自湖北钟祥，经湖北中医学院鉴定教研室鉴定为正品。
       1.2  试剂与配制DMSO、胰蛋白酶氯霉素、青霉素、EDTA购自Amresco公司；RPMI 1640（GIBCO产品）；RNase酶、碘化丙啶（PI）均购自Sigma公司；胎牛血清、新生牛血清（三利生物制品厂）。醋酸乙酯、石油醚、95%乙醇等其它均为国产分析纯。
       1.3  细胞系及培养人肝癌细胞系Bel7402由武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供，用50 ml的培养瓶，将人肝癌细胞系（Bel7402）接种于含100 u/ml青霉素、0.1 g/L链霉素和10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中，细胞浓度为2×104 ml，置于5% CO2，37℃的培养箱中培养。
       1.4  仪器SHELLRB CO2恒温细胞培养箱；Olympus倒置显微镜；SHZ82A恒温震荡器；无菌操作台（苏州净化设备厂）；流式细胞仪（BD公司FACSCalibur型）；高速冷冻离心机（上海安亭离心机厂）；902型定时恒温磁力搅拌器；LDZX40立式电热压力蒸气灭菌器等。
       2  方法及结果
       2.1  半夏蛋白的提取分离新鲜块茎半夏洗净去皮，加入4倍体积0.05 mol/L TrisHcl(pH8.0)缓冲液及少量石英砂，高速匀浆后离心（8000 r/min，30 min），收集上清液，即得粗蛋白。
        粗蛋白冷却到0℃，逐步加入固体（NH4）2SO4，当饱和度达到30%时，4℃静置2 h离心（8000 r/min，30 min），收集沉淀，得第1个分级沉淀部分。上清液继续加（NH4）2SO4至60%饱和度，4℃静置2 h后离心（8000 r/min,30 min），收集沉淀，得第2个分级沉淀部分。上清液加（NH4）2SO4至90%饱和度，静置无沉淀。
        将上述2个分级沉淀部分分别用蒸馏水溶解，装入透析袋（透过分子量8000），用蒸馏水在4℃透析脱盐，更换透析液在检测不出（NH4）2SO4为止，把透析袋放入吸水性强的聚乙二醇（PEG，分子量20000）中，浓缩至小体积离心后去除沉淀。
        将层析柱竖直固定在仪器车上，将DEAE Sepharose FF胶装入层析柱中，用0.05 mol/L TrisHCl(pH8.0)缓冲液平衡树脂，将30%（NH4）2SO4沉淀部分溶解后以0.5 ml/min上柱，分别以0.05 mol/L TrisHCl，0.05 mol/L NaCl, 0.10 mol/L NaCl, 0.15 mol/L NaCl, 0.20 mol/L NaCl溶液以1 ml/min速度洗脱，用HD3紫外检测仪测定A280，共出现4个比较明显的吸收峰，分别收集各峰，透析脱盐，浓缩。
       2.2  半夏蛋白对Bel7402细胞凋亡的影响操作方法同2.1项，样品用PBS溶解，终浓度也为0.05 mg/ml，空白对照加入等体积PBS，其它方法同前，结果见表1，流式细胞凋亡图见图1。表1  半夏蛋白对Bel7402细胞凋亡的影响（略）
        结果表明，60%硫酸铵沉淀蛋白没有明显诱导Bel7402细胞凋亡的作用，而30%硫酸铵沉淀蛋白有诱导Bel7402细胞凋亡的作用。30%沉淀进一步分离结果显示，只有0.1 mol/L NaCl洗脱峰（峰3）有一定诱导Bel7402细胞凋亡的作用。
       3  讨论
        细胞凋亡作为细胞死亡的一种方式，在肿瘤形成中有相当重要的地位，细胞毒性药物绝大多数是通过诱导细胞凋亡的途径而表现出抗肿瘤作用，因而通过细胞凋亡筛选抗肿瘤药物是一种有效的方法。
        流式细胞术测定细胞凋亡定量精确度高，但要求细胞数量很大，每样达到106个细胞（即半瓶到1瓶细胞的数量），加上实验重复和量效曲线关系的要求，则每个样就需要培养15～30瓶细胞才能进行比较完整的实验，实验工作量很大，耗时长，因此考虑首先采取对样品以同一浓度进行初筛，对效果比较好的样品再做量效关系考察。根据实验总结，初筛浓度药物终浓度为0.05 mg/ml比较好，因在进行细胞药物筛选时，一般认为当药物浓度超过0.1 mg/ml后，细胞的表现与药物的效果已没有明显直接关系，实验结果将缺乏实际意义。
        半夏蛋白30%硫酸铵沉淀部分有较强的促肿瘤细胞凋亡作用，在3个洗脱峰中，只有第3个峰有一定的诱导调亡作用，而且其作用尚不及30%沉淀本身，推测其它峰可能会有相当或更强诱导细胞凋亡的作用，因该峰与强阴离子交换剂有比较强的结合能力，属酸性较强的有机酸。
        利用PI染色测定细胞凋亡，测定的时相对细胞DNA正发生断裂，DNA片段化已出现，而更早期的时相，例如线粒体膜电位的改变、Caspase酶的活化、质膜不对称性的改变等与凋亡密切相关的信息，都不能通过PI染色检测，因而对于凋亡更早时相的检测，可通过其它染色方法结合流式细胞术进行分析。活化的Caspase酶作为细胞凋亡的必要信号分子，对于早期细胞凋亡的检测，具有很重要的意义，可在今后深入研究中加以利用。
        
       【参考文献】
         　　［1］陈 坚.中药治疗肝癌的实验研究进展［J］.中西医结合肝病杂志，2000，10（3）：55.
       
       ［2］郑国灿.半夏提取液的抗肿瘤性研究［J］.四川中医，2004，22（9）：9.
       
       ［3］张科卫，吴 皓，沈绣红.半夏中总有机酸的作用研究［J］.南京中医药大学学报，2001，17（3）：159.
       
       ［4］朱伟铭，周抗美，丁声颂，等.掌叶半夏总蛋白对卵巢癌细胞株及人脐造血细胞的作用［J］.上海医科大学学报，1999，26（6）：455.