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       【摘要】 
       目的研究天参益智方（TSYZ）对AD大鼠模型学习记忆障碍的保护作用，探讨其对AD大鼠脑内Aβ1-40沉积的影响。方法以慢性铝中毒法复制AD大鼠模型，用Moriss水迷宫法检测AD大鼠学习记忆能力；采用免疫组化法检测AD大鼠海马和皮质Aβ1-40水平。结果天参益智方治疗组逃出水迷宫的时间及搜索距离显著低于模型对照组(P<0.05， P<0.01)，大鼠海马和皮质的平均灰度值显著升高(P<0.01)， Aβ1-40水平明显低于模型组。结论天参益智方明显减少AD大鼠脑组织中Aβ1-40沉积，这可能是其改善AD大鼠学习记忆功能作用机制之一。
       【关键词】  天参益智方； 老年痴呆； 水迷宫； 学习记忆； β淀粉样蛋白
       
       Effects of TSYZ Formula on Learning-Memory and Aβ1-40 Levels in Hippocampus and Cortex of AD Model Mice
       LUO Xirong， LI Hongyan， HAO Xiaoyan， GUAN Zhizhong， LUO Jun
       Guiyang Medical College，Guiyang 550004, China
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of TSYZ formula on learning-memory and the depositions of beta-amyloid(Aβ1-40) in hippocampus and cortex of aged dementia model mice induced by AlCl3.MethodsThe aged dementia model mice were induced by long-term i.g AlCl3 . The abilities of learning-memory were tested by Morris water maze .The methods of immunohistochemistry were used to detect the deposition changes of beta-amyloid(Aβ1-40) .ResultsIn TSYZ formula  groups ,the mean escape latency and the mean searching distance in place navigation decreased significantly (P<0.05， P<0.01),and the mean gradation of hippocampus and cortex increased(P<0.01).ConclusionThe protective effects of TSYZ formula on learning-memory of AD model mice are remarkable. The machanism may be achieved by preventing Aβ1-40 from depositing and clearing deposited Aβ1-40.
       Key words：TSYZ formula;  Aged dementia;  Morris water maze;  Learning-memory;  Aβ1-40
        老年性痴呆（Alzheimer’s disease, 简称AD）是一种以记忆减退、认知障碍、人格变性为特征的中枢神经系统退行性病变。随着世界人口的老龄化，AD发病率呈不断上升趋势，目前该病列死亡原因第4位（仅次于心脏病、肿瘤和中风），成为当前老年医学所面临的最为严峻的问题之一。近年来，随着对AD研究的深入，中药及其提取物预防及治疗作用日益受到重视。笔者建立慢性铝中毒老年痴呆动物模型［1～4］，研究天参益智方（由天麻、人参、石菖蒲等组成）对AD大鼠各阶段学习记忆功能的影响，并探讨其治疗AD的作用机制，为研究开发疗效更高、毒性更小的AD治疗药物提供更多的思路。
       1  器材
       1.1  药物天参益智方，棕褐色粉末，由本院分析教研室提供。
       1.2  动物SD健康大鼠60只，体重（200±20） g，雌雄兼备，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。
       1.3  仪器与试剂Morris 水迷宫；BI2000图像分析系统（成都泰盟公司产品）；Biomias99图象分析系统（四川大学图象图形研究所产品）；EG1160石蜡包埋机(德国Leica公司生产)；RM2145轮转切片机(德国Leica公司生产)；HI1210摊片机(德国Leica公司生产)；三氯化铝（AlCl3·6H2O）（分析纯，上海盛龙化工有限公司生产）；脑复康 (杭州民生药厂生产)；ANTI-Aβ1-40、即用型SABC、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司产品）。
       2  方法
       2.1  痴呆模型建立、实验分组及药物治疗SD健康大鼠60只，随机分为正常对照组（n=10）和模型组（n=50）。模型组给AlCl3溶液，第1月和第2月按500 mg·kg-1·d-1灌胃，以后一直自由饮用1.6 g·L-1AlCl3溶液；正常对照组灌胃等容的蒸馏水，用水迷宫法检测其记忆改变情况。痴呆模型建立成功之后，模型组随机分为5组，每组10只，即脑复康组，天参益智方高、中、低剂量组和痴呆模型组，以上药量均配成0.6 ml液体灌胃给药,连续3个月，正常对照组、痴呆模型组灌以等体积的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。
       2.2  标本制备及检测指标
       2.2.1  学习记忆能力的测定水迷宫［5，6］由圆形水池、安全岛和记录系统3部分组成，水池直径120 cm，桶高60 cm，水池内壁涂成乳白色，迷宫中含牛奶液面高于安全岛1 cm，水温（25.0±0.5）℃，训练期间环境安静，迷宫参照物不变。池壁标记4个入水点，将水池分为4个相限，选A相限中点放置安全岛，记录系统为BI2000系统的行为学检测模块，实验大鼠分别于给药治疗1个月、2个月和3个月进行定向航行实验，检测其学习记忆能力：从池壁任意入水点将实验大鼠面向池壁放入水池，自动录像记录系统记录大鼠2 min内找到安全岛的时间（逃避潜伏期）和游泳路径（搜索距离），每次连续测试5 d，取其平均值。
       2.2.2  Aβ1-40免疫细胞化学染色及含量检测迷宫测试24 h后，大鼠断头取脑，用10％中性缓冲液福尔马林固定4 h以上，石蜡包埋切片，片厚5 μm，脱蜡后，采用SABC法 进行Aβ1-40免疫组化染色。每张切片随机选取5个视场，视场面积为443 268 μm2，每个视场选取5个阳性表达区域，在40×10倍光学显微镜下，通过SONY摄像头将科研动物组织免疫组化图象采集并输入本图象分析系统进行图象分析，测量其平均灰度值，检测大鼠海马和皮质内Aβ1-40的水平。
       2.3  数据统计数据处理采用±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析检验。
       3  结果
       3.1  定向航行学习记忆的测定结果见表1。表1  TSYZ对慢性铝中毒老年痴呆大鼠模型逃避潜伏期的影响（略）
        由表1和表2可以看出，治疗1个月后，天参益智方高、中剂量组和脑复康组均可使模型大鼠逃避潜伏期和搜索距离较模型组显著缩短（P<0.05或P<0.01）。治疗2～3个月后，天参益智方高、中、低3个剂量组均可使模型大鼠逃避潜伏期和搜索距离继续缩短（P<0.01），提示，天参益智方对AD大鼠学习记忆能力有明显的改善作用。表2  TSYZ对慢性铝中毒老年痴呆大鼠模型搜索距离的影响（略）
       3.2  天参益智方对慢性铝中毒老年痴呆大鼠模型海马和皮质Aβ1-40含量的影响结果见表3。表3  TSYZ对慢性铝中毒老年痴呆大鼠模型Aβ1-40含量的影响（了）
        经图像分析测定结果表明，模型对照组切片中可见明显的胞膜及胞浆黄染，与正常组比较，平均灰度值明显减少（P<0.01），提示模型组脑内Aβ1-40含量增高。与模型组比较，天参益智方组海马和皮质神经元染色较浅，平均灰度值均明显增高（P<0.01），提示天参益智方组Aβ1-40含量减少，对AlCl3引起的大鼠脑内Aβ1-40增多具有明显的抑制作用。结果见表3。
       4  讨论
        AD是老年人常见的痴呆类型，病因甚为复杂，可能与其基因遗传、β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积、铝蓄积、细胞凋亡等多种因素有关［7～9］。大量铝与AD的实验研究已表明：铝是慢性蓄积性神经毒物［1～4］，选择性地蓄积在大脑神经元内，产生神经毒性损害，引起Aβ在脑内沉积和β-淀粉样前体蛋白（β-APP）在神经元的过度表达。Aβ由40～42个氨基酸组成的肽链，其毒性作用的部位位于第25～35位氨基酸残基之间。研究证明脑中Aβ的过度沉积在神经细胞变性过程中起中心作用［10］ ，引起神经元退化和死亡。海马和皮质是学习记忆的关键部位，也是最易受Aβ毒性损害的区域。AD病人大脑海马、皮质等内有大量的Aβ，神经元变性、死亡，其中Aβ沉积量的多少与AD发生发展有重要关系。因此，抑制和清除Aβ的合成及沉积是突破AD治疗的关键环节。
        本研究观察到模型组在Morris水迷宫中的逃避潜伏期和搜索距离显著延长，说明模型组大鼠学习记忆能力受到铝盐明显损伤，给药天参益智方后， AD模型大鼠的学习记忆能力得到明显改善，表明天参益智方对AlCl3引起的记忆损毁有较好的保护作用，并且与剂量和治疗时间有相关性趋势。同时，Aβ1-40免疫组染色检测结果也表明，天参益智方能降低海马和皮质中Aβ1-40含量，其生物学作用基础可能是通过抑制所涉及的蛋白酶，阻止Aβ在海马和皮质中的合成和沉积，促进Aβ代谢，多方面干预Aβ神经毒性作用机制，从而保护脑组织神经元，延缓衰老和防治老年痴呆。
        老年性痴呆属于中医“文痴、善忘、语言颠倒”或智能减退的范畴。“痴呆”作为一种疾患，早在两千多年前的祖国医学文献中就已有论述。中医学认为老年性痴呆为本虚标实之症，学习记忆功能的减退不外乎“虚”“淤”“痰”3个方面。阴虚血少则见脑失所养，脾虚则气血生化乏源，痰浊内生，痰阻、血瘀则脑窍不通，精髓阴血不能上荣于脑，是构成智能障碍及老年性痴呆的基本病理［11］。笔者在组方时充分考虑老年患者脏腑精髓气血亏虚的现实，在组方中给予大量补肾填精、补脾益气的中药，同时针对标实（淤血、痰浊、心火、肝阳等）给予养血安神、平肝熄风、活血化淤、豁痰开窍等实现治疗AD的目的。
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