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       【摘要】 
       目的优选重楼皂苷的最佳提取工艺条件。方法以薯蓣皂苷元的含量为考察指标，用高效液相色谱（HPLC）法测定其含量，采用正交实验法对重楼皂苷的提取工艺进行优选。结果最佳提取工艺为重楼药材粗粉加8倍量85%的乙醇回流2次，1.5 h/次。结论优化得到的工艺简便易行，稳定性好。
       【关键词】  重楼；薯蓣皂苷元；提取工艺；正交实验
       
       Optimization of Extraction Process of Saponins of Paris Polyphylla with Orthogonal Design Method
       LU Rumei， SU Xing， CAI Shaofang
       Department of Pharmacy，Guangxi College of TCM，Nanning，530001，China
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process saponins of Paris polyphylla.MethodsThe orthogonal design method was used to optimize extraction process for saponins of Paris polyphylla with the extraction amount of Diosgenin as observing index.ResultsThe optimum extracting procedure was as follows: the raw powder of Paris polyphylla was extracted with 85% alcohol for two times, with 8 folds of the solvent volume and refluxing ninety minutes each time.ConclusionThe optimum extracting process is simple, stable and efficient.
       Key words：Paris Polyphylla;  Diosgenin;  Extraction process;  Orthogonal design method
        重楼为百合科植物云南重楼Pairs polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎［1］。重楼中的化学成分主要以甾体皂苷类为主，是其主要活性成分。其苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元［2，3］。现代药理研究表明该药具有抗肿瘤、抗菌消炎、止血、镇静镇痛、抑制精子活性、免疫调节等广泛的药理活性［4］。为了更好地开发利用重楼药材，为含重楼中成药制剂开发提供实验依据，本实验以薯蓣皂苷元转移率为指标，采用正交实验法对重楼皂苷的提取工艺进行优化选择获得最佳提取工艺条件。
       1  材料与方法
       1.1  仪器及材料
       Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，VWD紫外检测器，Agilent化学工作站；BP-211D分析天平(德国赛多利斯)；SB3200-T超声波提取仪（上海能信超声有限公司）；Millipore Simplicity-185超纯水器(美国密里博公司)；薯蓣皂苷元对照品（中国药品生物制品检定所）；重楼药材（购于广西中医学院一附院仁爱分院药房）；HPLC用水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。
       1.2  色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 (4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：乙腈：水（80:20）；柱温：30℃；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：203 nm；理论塔板数按薯蓣皂苷元峰计不应低于8 000。
       1.3  对照品溶液的制备精密称取薯蓣皂苷元对照品5.04 mg，用甲醇定容至10 ml，摇匀，即得。
       1.4  供试品溶液的制备及测定重楼药材经干燥并粉碎后，准确称取3 g，按正交设计进行回流提取，趁热滤过，合并二次提取液，回收乙醇至干。加2 mol/L的盐酸30 ml，置于沸水浴中水解2 h，冷却后用石油醚(60～90℃)萃取5次，20ml/次，合并萃取液，水洗至中性，回收石油醚至干，残渣用甲醇溶解定容于25 ml容量瓶中，作为供试品溶液。在上述色谱条件下，分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，进样测定，计算供试品液中薯蓣皂苷元含量。
       1.5  线性关系考察精密吸取薯蓣皂苷元对照品溶液5,10, 15, 20, 25 μl，进样，测定，以薯蓣皂苷元的量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为 Y=616.313 5X+52.910 0，r=0.999 9，表明薯蓣皂苷元含量在2.52～12.6μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
       1.6  正交实验方案设计根据重楼活性成分的性质及初步预试验结果，采用L9(34)正交表安排重楼用乙醇提取工艺，以薯蓣皂苷元的转移率为评价指标，选择乙醇浓度、溶剂用量、提取时间3个因素，每个因素设3个水平，因素水平见表1，实验设计结果见表2，方差分析见表3。表1  重楼皂苷提取工艺因素水平（略）表2  乙醇提取工艺正交实验设计及结果（略）表3  方差分析（略）
       2  结果
       2.1  直观分析由直观分析（表2）得各个因素的主次顺序为C>A>B，即回流时间>乙醇浓度>乙醇用量，最佳方案为C3A2B3。
       2.2  方差分析由方差分析（表3）得各个因素的主次顺序为C>A>B，乙醇浓度和回流时间对结果有显著性影响，乙醇用量对结果的影响无显著性，但是用8倍量提取对提取效果还是有明显的增强，结合实际生产，将乙醇倍数选为8倍，即提取工艺为A2B3C3，即加85%乙醇8倍量，回流提取两次，1.5 h/次。
       2.3  验证性实验准确称量重楼药粉3份，每份3 g按照最佳方案A2B3C3进行回流提取，并按供试品溶液制备和测定的方法进行样品处理。样品用HPLC测定薯蓣皂苷元平均含量为6.082 1 mg/g。
       3  讨论
        《中国药典》（2005版）有记载薯蓣皂苷元的HPLC测定条件为乙腈∶水（90∶10），柱温：35℃，色谱柱：C18柱。通过比较C18柱没有C8柱的分离效果好，同时用C8柱时流动相为乙腈∶水（80∶20）比乙腈∶水（90∶10）好，所以本文HPLC测定条件较药典有所改动，可使薯蓣皂苷元与其它成分达到基线分离，并且峰形及保留时间均较适合。
        在初试比较中发现药材粉末粒度对薯蓣皂苷元的提取量有明显影响，药材粉末越细同样条件下提取量越高，但同时过滤就越困难。建议药材粉末过药典2号筛即可，同时用抽滤加快过滤速度。
        本文确定的重楼皂苷最佳提取工艺，可用于实际生产中作为参考。
        
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会．中国药典，I部［S］．北京：化学工业出版社，2005：183.
       
       ［2］陈昌祥．滇重楼地上部分的甾体皂苷［J］．云南植物研究， 1990，12(3)：323.
       
       ［3］汤海峰，赵越平，蒋永培．重楼属植物的研究概况［J］．中草药，1998，29 (12)：839.
       
       ［4］武姗姗，高文远，段宏泉，等．重楼化学成分和药理作用研究进展［J］．中草药，2004，35(3)：344.